Tomografia Crio-Eletrônica (Crio-ET): Sua amostra está pronta para biologia estrutural In Situ?

As aplicações mais promissoras da criotomografia eletrônica não são apenas: "Como é essa proteína?", mas também: "Como é essa estrutura onde realmente funciona?"

Essa distinção importa. O complexo purificado também pode oferecer um nível perfeito de detalhe estrutural, eliminando membranas, complexos adjacentes, estrutura celular ou viral importante para a questão biológica. O Cryo-ET enfrenta esse desafio de forma diferente, fazendo várias projeções de uma amostra vitrinada para reconstruir um volume 3D.

Atualmente, a Longlight oferece o Cryo-ET como uma abordagem estrutural in situ para montagens biológicas, complexos associados a membranas e sistemas virais como parte de seu Serviço de microscopia crio-eletrônica.

A questão prática, no entanto, para a coleta de dados é,

A questão biológica é realmente uma que exige tomografia?

Leve a Questão Biológica antes do Microscópio

Às vezes, os cientistas comparam o Crio-ET à análise de partícula única, sugerindo que uma delas precisava ser superior à outra.

Normalmente não é uma comparação direta.

Crio-EM de partícula única pode ser um caminho mais direto para uma estrutura média de alta resolução se um complexo macromolecular purificado e relativamente homogêneo puder responder à questão biológica. No entanto, o Crio-ET torna-se muito atraente se a posição/orientação, vizinhança molecular, ambiente de membrana ou organização celular do alvo forem relevantes.

Longlight's guia para Crio-EM de resolução quase atômica oferece algum contexto sobre o caminho de partícula única; Crio-ET levanta outra questão: o que pode ser visto quando o contexto biológico é mantido?

Primeiro Limite Físico — Acessibilidade aos Elétrons

Se uma amostra é biologicamente interessante, isso não significa necessariamente que ela seja acessível por elétrons.

A tomografia criogênica direta pode ser possível para vírus ou outros organelos isolados, pequenas células e áreas periféricas finas das células. Alguns fluxos de trabalho in situ incluem o afinamento de amostras, necessário para imagens de transmissão úteis de células eosinucleicas maiores que são grossas demais para imagem.

Um método bem estabelecido para fazer lamelas finas de células é a fresagem por feixe de íons focados criogénicos (FIB). Células eucarióticas crio-FIB moldadas têm sido usadas em estudos in situ para tornar estruturas internas acessíveis para tomografia e subsequente análise estrutural.

O planejamento da amostra não deve começar com a voltagem do microscópio! Deve incluir 'de onde' e 'como', o feixe de elétrons chegará ao alvo.

Uma série Tilt NÃO é um monte de fotos, é um Dose Budget.

O Crio-ET não obtém informações sobre a terceira dimensão a partir de uma única exposição.

Esse espécime é inclinado várias vezes e uma série de projeções 2D é capturada. Isso se deve à sensibilidade à radiação de amostras biológicas congeladas e as projeções devem ser consideradas com um orçamento total limitado de doses eletrônicas. A espessura efetiva pela qual os elétrons passam também aumenta em ângulos de inclinação maiores, o que significa que menos sinal pode ser utilizado.

Na tomografia convencional, uma aquisição completa de ±90° também não é possível devido à geometria mecânica e à espessura da amostra. A informação não amostrada cria a conhecida cunha ausente no espaço de Fourier.

Mas mais projeções não necessariamente significam melhor. A interação entre a faixa de inclinação, distribuição da dose, qualidade do alinhamento, estabilidade da amostra e visibilidade do alvo deve ser considerada.

Determine se você precisa de um Tomograma, uma estrutura repetida.

Nem todos os projetos de Crio-ET precisam culminar em um modelo molecular quase atômico!

Frequentemente, a tomografia sozinha já fornece uma resposta para a pergunta: Onde está localizada uma estrutura? O que acontece com uma membrana quando ela é distorcida? Qual é a organização dos componentes virais? Quais complexos são adjacentes uns aos outros?

Um objetivo diferente será exibido quando houver múltiplas cópias do mesmo complexo macromolecular. Os alvos repetidos podem ser extraídos como subtomogramas, alinhados, classificados e mediados para potencializar o sinal estrutural.

Neste artigo, Longlight já fornece uma explicação detalhada dessa rota. A questão principal para um novo projeto é, portanto, feita logo de cara: Essa é uma arquitetura 3D única ou existem cópias semelhantes suficientes para fazer a média?

O gargalo oculto pode se tornar a localização do alvo.

Escolher a melhor área móvel pode ser tão importante quanto obter uma série de inclinação tecnicamente boa.

Suponha que o alvo seja apenas uma pequena parte de uma célula grande. Mesmo que você tenha um tomograma bonito da área errada, ainda é o conjunto de dados errado.

Para serem coletados, eles devem, portanto, levar em conta a abundância do alvo, a localização aproximada das células, sua morfologia reconhecível, as informações disponíveis sobre a rotulagem e se outra estratégia de localização é necessária.

Esse mapa biológico pode aprimorar significativamente a lógica do plano de aquisição para alvos associados a membranas, locais de montagem viral, organelas ou complexos espacialmente restritos.

Planejamento pré-sessão para o Data Path:

Quando uma série tilt é adquirida, um projeto Crio-ET não está concluído.

As imagens ainda devem ser alinhadas, reconstruídas em tomogramas e examinadas, buscadas por alvos e segmentadas, e, se adequado, transferidas para extração de partículas, classificação e média subtomograma.

Por isso, o entregável desejado deve ser estabelecido antes da cobrança.

No atual serviço Cryo-EM da Longlight, focamos na entrega de mapas finais de densidade, mas também de dados brutos e arquivos intermediários de processamento. Isso é útil quando um pesquisador deseja verificar decisões de processamento, realizar análises subsequentes dentro do sistema ou retornar ao conjunto de dados em uma data posterior.

Combinar a Plataforma com a Etapa do Projeto

A qualidade do instrumento não deve ser usada para resolver uma questão de amostra indeterminada.

A triagem inicial pode indicar se a preparação da amostra, distribuição de partículas, qualidade do gelo e/ou visibilidade do alvo devem ser melhoradas antes do investimento em tempo caro de coleta.

A Longlight anunciou hoje uma plataforma crio-EM em estágio composta por Talos L120C G2 para triagem, Glacios 2 a 200 kV para crio-EM/tomografia rotineira e Titan Krios G4 a 300 kV para aquisição de alto nível. Também está ligado a fluxos de trabalho de proteínas a montante por meio de sua ampla extensão Aplicação de proteínas portfólio que combina análise estrutural com seu portfólio.

A regra prática da pesquisa é:

A amostra está pronta, vá para o próximo instrumento, não porque está disponível.

Este é o Teste Final do Projeto Crio-ET.

Com relação à encomenda de uma amostra para tomografia crioetrónica eletrônica, há cinco questões a considerar:

Existe necessidade de contexto espacial nativo? A área de interesse da molécula é acessível ao elétron? Existe uma mira confiável do alvo? Eca, um tomograma ou partículas repetidas? Você sabe que tipo de produtos de dados serão necessários após a aquisição?

Uma vez decididas essas respostas, a seleção do equipamento e a estratégia de processamento ficam muito mais simples.

O poder da crio-ET é que preserva informações perdidas durante a purificação. No entanto, isso só será útil se a preparação da amostra, a estratégia de imagem e a questão biológica forem co-projetadas como um único projeto.

Pesquisadores podem consultar com Longlight em um projeto estrutural in situ, após descrever a eles o tipo de amostra que vão usar, o local alvo, o tipo de estrutura que desejam alcançar e a análise a jusante que vão utilizar.

FAQ

P1. Tomografia crio-eletrônica (Crio-ET)?

Crio-ET envolve tirar várias imagens de uma amostra biológica nas vitrinas sob diferentes ângulos e depois reconstruir isso em um tomograma 3D. Um grande benefício é que mantém a informação estrutural em um ambiente biológico próximo ao nativo.

P2. Quais são as condições adequadas para usar crio-ET em vez de crio-EM de partícula única?

Considere crio-ET quando a posição da célula, organização da membrana, vizinhos moleculares ou arquitetura nativa é um fator chave para a questão de pesquisa. Quando a partícula purificada/estrutura molecular média é o foco, a SPA costuma ser mais direta.

P3. A fresagem crio-FIB deve ser usada para todas as amostras de crio-ET?

Não. É possível obter imagens diretas de espetáculos naturalmente afinados. Em regiões mais espessas da célula, pode ser necessário um afinamento para criar uma parte eletrônica transparente da célula e assim adquirir a tomografia.

P4. O que falta no Crio-ET?

Carece de informações 3D do alcance angular limitado que pode ser adquirido durante séries de inclinação. Pode causar anisotropia, artefatos de reconstrução, que precisam ser considerados na análise.

P5. A média por subtomograma precisa ser realizada para todo projeto realizado em crio-extra?

Não. Um único tomograma pode ser suficiente para responder perguntas relacionadas à morfologia ou organização espacial. O valor da média por subtomograma está na possibilidade de alinhamento e média de várias cópias semelhantes de um alvo quando elas estão disponíveis.