Sistema de Imagem de Biologia Molecular: Escolhendo a Plataforma Certa para Géis e Blots

Um sistema de imagem de biologia molecular fornece uma saída digitalizada de um gel ou membrana que pode ser visualizada, quantificada, armazenada e comparada. Ele pode ser configurado para escanear géis contendo DNA e RNA, géis proteicos coloridos, Western blots quimioluminescentes, blots fluorescentes e amostras colorimétricas.

Um sistema deve ser usado para ajustar o ensaio e não o contrário.

Como funciona um Sistema de Imagem em Biologia Molecular?

Um sistema de imagem padrão incluiria uma câmara à prova de luz, câmera, lente, estágio de amostragem, fontes de luz que podem ser usadas para a excitação desejada, filtros que permitem que ela passe apenas luz com uma certa frequência de emissão, software para a câmera registrar a imagem e software para análise da imagem.

No caso dos géis de ácido nucleico, o instrumento projeta luz UV, azul ou outra luz apropriada sobre uma mancha fluorescente. A luz branca é frequentemente usada para géis de proteína que são visíveis. A luz produzida nos Western blots quimioluminescentes é de sua própria criação e vem de uma reação química, então há necessidade de uma câmera sensível e uma câmara de imagem escura, mas não de alta intensidade de luz na amostra.

Algumas plataformas tudo-em-um possuem capacidades de documentação em gel, imagem colorimétrica, quimioluminescência e fluorescência em um único invólucro. Por exemplo, o bio-Rad fornece sistemas para imagear géis de ácidos nucleicos, proteínas e manchas quimioluminescentes, e os sistemas podem ser expandidos com um canal visível, canais fluorescentes de vermelho distante e infravermelho próximo.

Você pode começar com as amostras que você roda

O primeiro lugar para começar é na bancada de laboratório — não na ficha técnica!

Para um laboratório de ensino com foco principal em géis de agarose, imagens UV, de luz azul e de luz branca podem ser os únicos tipos exigidos. Um laboratório preciso de pesquisa proteica requer quimioluminescência delicada e vários canais fluorescentes.

A Thermo Fisher divide seus sistemas de visualização em aqueles que fornecem apenas visualização e aqueles que fornecem análise de software, além de Western blot quimioluminescente e imagens fluorescentes multicanais. Um lembrete útil: o sistema de documentação em gel não é necessariamente um nível de instrumento como o imageador molecular multimodo.

Compare a fonte de excitação e o filtro com a mancha

Cada corante fluorescente possui uma faixa ótima de comprimentos de onda para sua iluminação e para a emissão da luz. O sistema de imagem deve estar equipado com uma fonte de luz apropriada para excitar o corante, e com um filtro de emissão que permita que os fótons de emissão (fluorescência) cheguem à câmera enquanto rejeita a luz usada para excitar o corante.

A seguir estão exemplos de sistemas que podem conter:

• Transiluminação UV
• Transiluminação com luz azul
• Luz branca transmitida
• Luz branca refletida
• Excitação fluorescente visível
• Excitação fluorescente no infravermelho próximo

Não há correlação entre o número de fontes de luz e sua qualidade. O importante é se os comprimentos de onda e filtros instalados forem compatíveis com as colorações, anticorpos e marcadores fluorescentes já usados no laboratório.

Verifique a lista de reagentes do laboratório antes de comprar um sistema para garantir que ele seja suportado pelas aplicações. Por favor, esteja ciente de que nem todos os corantes fluorescentes podem ser capturados porque o sistema é chamado de "imager de fluorescência".

Quimioluminescência e Fluorescência são muito semelhantes

No western blot quimioluminescente, a luz é gerada por uma reação quimioluminescente que geralmente é baseada em uma enzima de anticorpos e um substrato luminescente. O sinal mudará com o tempo – a imagem deve ser iniciada dentro da faixa de tempo de trabalho recomendada para o reagente.

O Western blotting feito por fluorescência requer a luz externa da excitação. Pode ser usado para multiplexar experimentos, assim múltiplos alvos podem ser detectados na mesma membrana por meio de canais fluorescentes diferentes.

A quimioluminescência é geralmente empregada para detecção sensível e rotineira. Quando multiplexação, captura estável de sinal ou comparação quantitativa são cruciais, frequentemente se opta pela fluorescência. Não existe um método único e melhor, pois ele dependerá dos requisitos do ensaio, da quantidade do alvo, dos anticorpos, dos rótulos usados e dos objetivos da análise.

Se um laboratório realiza rotineiramente ambos os testes, deve garantir que o sistema proposto permita que os testes sejam realizados como estão e sem envolvimento de mudanças complexas de hardware.

Ao fotografar, considere a faixa dinâmica e a saturação

Alguns blots podem ter uma faixa muito forte e várias faixas fracas. A banda forte pode ficar saturada se a exposição for longa o suficiente para mostrar sinais fracos.

Quando há tanta luz que os pixels da câmera não conseguem mais capturar. Depois desse ponto, a clareza aparente da faixa exibida será preservada, mas o nível de intensidade não poderá ser usado para comparação quantitativa.

Faixa dinâmica é a faixa de sinais fracos a fortes que um sistema de imagem consegue registrar em uma única imagem. Uma faixa dinâmica maior permite gravar mais facilmente as bandas fracas e intensas sem perder nenhuma informação.

Algumas plataformas de imagem podem detectar pixels saturados, sugerir uma exposição adequada ou usar múltiplas exposições. Elas podem diminuir o número de tentativas e erros, mas não têm a intenção de substituir um bom desenho experimental. Mesmo que as amostras estejam sobrecarregadas, elas ainda devem ser corrigidas durante a fase de ensaio e sinais de anticorpos muito fortes também devem ser corrigidos.

O uso da Exposição Automática deve ser evitado

A exposição automática pode ser útil se várias pessoas estiverem se revezando no instrumento, ou se houver fatores que possam dificultar a medição da intensidade do sinal.

Alguns sistemas obtêm exposições iniciais curtas e depois sugerem uma exposição geral com base nisso. Fontes de luz, foco e configurações de aplicação são selecionadas automaticamente por outras pessoas.

Isso pode permitir que as imagens de rotina sejam mais rápidas, mas por favor, verifique com o operador. Verifique se:

• Nota: A saturação é indicada para bandas importantes.
• Faixas fracas podem ser vistas sobre o fundo
• Todo o campo de visão é coberto pela amostra completa.
• Para obter melhores resultados, foi utilizado o modo correto de imagem.
• O filtro e a bandeja necessários foram usados
• A seguir são análises quantitativas e exigem os trajes de exposição:

Configurações automáticas são um bom ponto de partida, mas NÃO são desculpa para não inspecionar a imagem.

Certifique-se de que a resolução, sensibilidade e campo de visão estejam corretos

A resolução é importante para a imagem capturada por uma câmera, mas o número de megapixels não indica a qualidade de imagem da câmera.

Também é importante ter um sistema útil, suficientemente sensível, com baixo fundo, boa ótica, uniforme e com campo de visão amplo o suficiente para acomodar os géis ou membranas usados no laboratório.

Se os sinais quimioluminescentes forem fracos, será necessária uma câmera muito sensível. Quanto maior a distância entre as bandas, menor a resolução é necessária; quanto menor a distância entre as bandas e mais importante for a resolução, e quanto menor for a característica da amostra a ser separada, maior será a resolução necessária.

Coloque a maior lamineira de gel de laboratório, blot ou multi-gel no local da imagem antes da compra. Se um gel grande for cortado em várias imagens, há esforço desperdiçado e comparações serão mais difíceis.

Garanta que as imagens sejam adquiridas de forma consistente

Recomenda-se tirar imagens sob as mesmas condições ao comparar imagens.

Anote o modo de imagem, o tipo de fonte de luz, o filtro, o tempo de exposição, o binned, o foco, a posição da amostra, as configurações de análise e qualquer correção de fundo e qualquer coisa. Se necessário, reutilize protocolos que forem salvos.

Se estiver colorindo ou descolorando, certifique-se de que as condições sejam as mesmas para géis de ácidos nucleicos e proteínas. Controle a carga das amostras controle, a concentração dos anticorpos, o tempo do substrato e o manuseio da membrana em Western blots.

O imageador só poderá registrar a amostra em que foi colocado. Não consegue corrigir transferências irregulares, muito fundo, faixas sobrecarregadas ou falta de especificidade de anticorpos.

Teste o Software de Análise

Tarefas comuns não deveriam ser difíceis de realizar com softwares de análise de imagem, e o software não deve obstruir a produção do resultado.

Algumas funções legais podem ser:

• Detecção de faixas e bandas
• Estimativa de peso molecular
• Subtração de fundo
• Medição de intensidade de banda
• Avisos de saturação
• Normalização
• Exibição de canal multiplex
• Anotação de imagem
• Exportação de dados
• Quando o usuário ou o experimento é gravado.

A análise embutida é uma vantagem para o trabalho rotineiro, e o software desktop pode ser mais adequado para análises detalhadas, bem como para a preparação da figura final. Por exemplo, sistemas de imagem termoFisher oferecem aquisição e análise a bordo, além de fluxos de trabalho de software externos.

Mantenha o arquivo original da imagem como está o máximo de tempo possível. Para ajustar, a imagem exibida não deve substituir os dados brutos de aquisição.

Certifique-se de tomar precauções e tomar medidas extras para garantir que suas amostras estejam seguras

É importante fornecer proteção adequada, pois a luz ultravioleta direta ou refletida emitida pelo dispositivo de imagem UV pode causar danos aos olhos e à pele. A exposição pode ser reduzida ao fechar a câmara de imagem, que é menor em comparação com uma caixa de luz UV aberta.

Se o DNA for extraído do gel, usar excitação com luz azul pode ser melhor para colorações apropriadas de ácidos nucleicos. A imagem de luz branca elimina o uso de UV para visualizar as colorações de proteínas visíveis.

O sistema também deve ser projetado para garantir que a contaminação entre amostras seja prevenida. Lave as bandejas de amostras, elimine vazamentos de tampão o mais rápido possível e siga as orientações do fabricante para a limpeza dos filtros, lentes e superfícies de imagem.

Certifique-se de que o Sistema esteja configurado como um Instrumento Óptico

O imageador de biologia molecular não pode ser limpo apenas de vez em quando.

Fontes de luz se desgastam com o tempo, filtros podem ficar riscados, bandejas de amostras podem manchar e a poeira pode afetar a qualidade da imagem. Os laboratórios devem acompanhar a iluminação, verificar bandejas e filtros, fazer cópias de segurança dos protocolos de aquisição, atualizar cuidadosamente o software e manter a documentação da manutenção.

Quando a qualidade da imagem não for boa, faça todo o processo e veja se há algum problema com a câmera ou com o restante da rede. Isso pode ser causado pela mancha, pela amostra ou substrato, pelas configurações de exposição, pela fonte de luz ou pelo filtro.

Conclusão

A plataforma mais útil nem sempre é aquela que tem mais recursos. É aquele que oferece a iluminação, sensibilidade, faixa dinâmica, software, área de imagem e fluxo de trabalho certos que outros usuários conseguem reproduzir.

Sua boa imagem começa na fase de preparação da amostra. O instrumento registra o experimento, mas, se a preparação do ensaio for cuidadosamente feita e a aquisição repetida, então a imagem (registro) é significativa.

Perguntas frequentes

P1. O que um Sistema de Imagem de Biologia Molecular pode capturar?

Ele é capaz de capturar géis de DNA e RNA, géis de proteína, western blots quimioluminescentes, western blots fluorescentes e membranas colorimétricas, dependendo das configurações.

P2. Qual é a diferença entre um Sistema de Documentação de Gel e um Imageador Western Blot?

Nem sempre. O sistema básico de gel pode suportar apenas imagens com luz UV, azul e branca, e os sensores Western blot podem exigir detecção sensível de quimioluminescência ou fluorescência multicanal.

P3. Por que a faixa dinâmica é importante? Por que a faixa dinâmica é importante?

Uma ampla faixa dinâmica de sinais permitirá capturar os sinais fracos e fortes sem saturar os mais fortes. Isso é especialmente verdadeiro para a análise quantitativa.

P4. A Exposição Automática pode ser confiável?

Pode ser útil determinar a faixa inicial de exposição. O operador também deve observar outros fatores, como saturação, fundo, sinais fracos e modo de imagem.

P5. Qual é o melhor Modo de Imagem?

O modo utilizado depende da amostra, coloração, rótulo e objetivo de análise. A fonte de luz, o filtro e as configurações da câmera dependem do ensaio.