Transiluminador UV: Escolhendo e Usando o Sistema Certo para Visualização de Gel

o resultado é problemático em um transiluminador UV. Ele lê DNA, RNA ou bandas de proteínas de forma simples, passando luz ultravioleta por um gel corado. O operador pode então examinar o gel, tirar uma foto dele ou cortar a faixa desejada para trabalhar com ele posteriormente.

A maioria dos problemas está relacionada a outros problemas além do interruptor de energia. Esses fatores são causados por comprimento de onda incorreto, iluminação e mancha incompatíveis, exposição muito longa e falta de proteção contra UV.

Um bom fluxo de trabalho com transiluminador UV deve fornecer bandas claras, com apenas a quantidade mínima de exposição à amostra e à pessoa que usa o instrumento.

Como funciona um transiluminador UV

O gel é então eletroforizado, deixando para trás fragmentos moleculares que geralmente não são visíveis a olho nu. Uma mancha fluorescente que se fixa ou interage com o material a ser tingido. O gel tingido é então transferido para a superfície iluminada e o corante é excitado pela luz ultravioleta, emitindo uma fluorescência visível a olho nu.

O fundo escuro e as faixas brilhantes permitem aproximar o tamanho dos fragmentos, comparar a intensidade das amostras, verificar produtos de amplificação ou encontrar material para extração em gel.

Existem vários transiluminadores UV disponíveis em comprimentos de onda padrão de 254, 302 e 365 nm. Alguns oferecem um único comprimento de onda, outros oferecem dois ou três; Qual é o melhor depende do tipo de instrumento e do comprimento de onda desejado. Aplicações de visualização em gel e eletroforese utilizam uma ampla faixa de UV próxima a 302 nm.

Selecione o comprimento de onda para a aplicação real

A intensidade da fluorescência, o dano à amostra e a compatibilidade das colorações são influenciados pela seleção do comprimento de onda.

Uma fonte de 302 nm é frequentemente empregada ao observar géis de DNA e RNA corados fluorescente, pois geralmente gera um sinal de alta intensidade e muitas colorações conhecidas de ácidos nucleicos podem ser usadas com essa fonte. Uma solução fácil para verificações e documentação de rotina com gel.

Se a redução do dano ao DNA induzido pelo UV for mais importante do que o sinal mais forte possível, pode-se considerar usar UV de onda longa, que está próxima a 365 nm. Thermo Fisher aconselha minimizar a exposição ao DNA e sugere o uso de um comprimento de onda maior (cerca de 360 nm) se o DNA for recuperado do gel.

O uso de UV de ondas curtas (próximo a 254 nm) para visualização rotineira de géis de DNA não deve ser considerado automático, embora alguns transiluminadores de laboratório estejam disponíveis. É adequado para uso dependendo do material fluorescente e da aplicação no laboratório.

O maior comprimento de onda, portanto, não é a opção mais eficaz. É aquele que combina com a mancha e mantém a amostra suficientemente para a etapa seguinte.

Use um stain de gel de cor diferente para uma fonte de luz de cor diferente

Um transiluminador e uma coloração em gel devem ser considerados como um único sistema óptico.

Existem diferentes tipos de corantes com características distintas de excitação e emissão. Uma mancha pode ter alta refletividade UV e baixa refletividade da luz azul, e vice-versa. O filtro da câmera também deve permitir a passagem da fluorescência emitida e evitar a passagem de radiação de excitação indesejada.

Antes de um novo ensaio:

• Os comprimentos de onda que excitam a mancha são lequel. Os comprimentos de onda que excitam a mancha são 'luequels'.
• A decisão de usar ou não um filtro fotográfico será determinada pelo fotógrafo individual.
• Os atributos da substância coloridora (DNA, RNA ou proteína)
• Se o gel for cortado ou não, como isso será documentado?
• Se a fonte de luz for uma tecnologia nova, existe algum método para capturá-la usando o sistema de imagem atual?

Por exemplo, géis corados SYBR Safe podem ser imaginados usando equipamentos de fluorescência apropriados, com filtro de luz UV ou azul – um filtro usado para imagem de brometo de etídio pode não ser adequado.

Se uma imagem é muito fraca, isso não significa necessariamente que há pouco DNA no gel. A causa pode ser um comprimento de onda de excitação inadequado, filtro de câmera errado, lâmpadas UV desatualizadas ou luz excessiva do ambiente.

Se o dano ao DNA for recuperado, limite a exposição aos raios UV

Os ácidos nucleicos são suscetíveis a danos causados pela luz UV. Isso é significativo se o pesquisador deseja extrair uma faixa de DNA do gel e utilizar o DNA restante em aplicações posteriores, como clonagem, ligação, sequenciamento ou outras aplicações.

A exposição prolongada pode levar ao corte do DNA, além de outros danos, o que pode afetar a qualidade do DNA recuperado. A exposição prolongada à luz UV pode causar danos ao DNA, o que pode afetar aplicações posteriores, como a subclonagem, aponta Thermo Fisher.

Caso seja necessária visualização UV:

1. Prepare ferramentas de corte e tubo de coleta antes de acender a luz.
   1. Ajuste a configuração mais baixa que gerará uma faixa livre.
   1. A exposição deve ser mantida no mínimo.
   1. Se possível, pense em um comprimento de onda maior para a luz UV.
   1. Não veja repetidamente o mesmo gel.
   1. Anote a faixa escolhida e desligue a fonte.

Um transiluminador de luz azul compatível para clonagem pode ser mais adequado para trabalhos de clonagem particularmente sensíveis. As cores podem ser excitadas pela luz azul, e menos danos foram causados ao DNA pela luz azul.

Verifique a uniformidade da iluminação

O transiluminador deve fornecer iluminação uniforme da área a ser observada.

Se um lado da superfície for mais intenso que o outro, faixas idênticas terão intensidades variadas dependendo da localização no gel. Isso é particularmente relevante quando as pistas são comparadas no mesmo laboratório e/ou quando uma imagem é empregada para análise semi-quantitativa.

A uniformidade é influenciada pelo estado das lâmpadas, pela disposição das lâmpadas, filtros, limpeza das superfícies e pelo design óptico do instrumento. A iluminação uniforme é importante no contexto da UVP para alcançar a repetibilidade dos resultados em várias faixas e pistas.

Sempre examine o fundo para ver se está uniforme durante todo o gel, antes de depender da intensidade da faixa. Transferir o mesmo gel para outra parte da superfície pode ajudar a desenvolver um problema de iluminação.

Use a área de observação correta

A área iluminada deve ser suficiente para cobrir o gel, mas sem ocupar espaço extra no banco.

Uma célula pequena é ótima para mini-géis padrão. Plataformas maiores serão melhores para géis de grande formato, ou múltiplos géis lado a lado. Existem sistemas comerciais disponíveis com diferentes áreas iluminadas, tipicamente de cerca de 20 x 20 cm ou mais.

Todo o gel deve ficar liso na superfície. Reflexos e desfoque das faixas são possíveis devido a rugas no filme protetor, excesso de buffer ou bandeja irregular.

Certifique-se de que a superfície de observação esteja limpa; Use apenas materiais e agentes de limpeza que sejam compatíveis com o filtro UV. As imagens podem ser afetadas por riscos, manchas ou depósitos tampão secos.

Certifique-se de proteger o usuário contra a exposição a raios UV

Um transiluminador UV NÃO é uma lâmpada de visualização padrão, mas uma fonte de luz de alta intensidade projetada para uso em laboratório.

Tanto a exposição direta quanto indireta à radiação UV pode causar danos nos olhos e na pele. As diretrizes de segurança laboratoriais de Stanford listam as seguintes precauções para o uso de um transiluminador: manter o acesso ao transiluminador sob controle durante o uso, manter superfícies refletivas afastadas do transiluminador e colocar placas indicando que a pele e os olhos devem ser protegidos.

Sempre utilize a tampa protetora, a proteção ou o gabinete de imagem fechado fornecido com o instrumento. Práticas laboratoriais que exigem trabalhar com o gel podem exigir cobrir o rosto, usar luvas, um jaleco fechado e cobrir a pele com bloqueadores de UV.

Não presuma que óculos de segurança normais bloqueiam o comprimento de onda UV. Use equipamentos de proteção adequados que tenham sido designados para o instrumento e cumpra as regras de segurança contra radiação do laboratório.

Um melhor controle de exposição é alcançado com um sistema fechado de documentação em gel com bloqueio de segurança, em vez de trabalhar sobre uma caixa de luz aberta. Alguns sistemas não permitem que a porta de imagem seja aberta enquanto operam no modo UV.

Os educadores devem estabelecer um fluxo de trabalho consistente de visualização

Existe uma faixa simples que pode ser usada para minimizar variabilidade desnecessária:

• Eletroforese e coloração 1. Eletroforese e 1 coloração.
• Certifique-se de que a mancha esteja no comprimento de onda correto.
• Certifique-se de que a parte externa da bandeja de gel esteja limpa e seca.
• Escolha o comprimento de onda e a intensidade do UV necessário.
• Coloque o gel na área de observação no centro.
• Feche o escudo protetor/caixa de imagem.
• Utilize o menor tempo de exposição possível para produzir bandas visíveis.
• Tire a foto com o filtro de emissão apropriado.
• Desligue a luz UV ao mover o gel.
• Limpe a superfície após o uso.

Ao realizar vários experimentos, a concentração da coloração deve ser a mesma, assim como o filtro de imagem, o tempo de exposição, a configuração de intensidade e as condições da câmera.

Conecte o Transiluminador ao Fluxo de Trabalho de Imagem

Se o usuário não precisar inspecionar um gel, então um transiluminador de bancada pode ser utilizado. Para aplicações mais exigentes, é necessário um sistema completo de documentação em gel, incluindo câmera, gabinete escuro, filtros e software de análise de imagem.

Sistemas integrados podem ser usados para captura de imagens, medição de bandas, documentação e análise regular de gel. O Bio-Rad caracteriza plataformas de documentação em gel, que possuem iluminação controlada e software automático de aquisição e análise de imagens.

A decisão vai depender do que o laboratório vai fazer com a imagem. Em um laboratório de pesquisa, o laboratório de ensino pode precisar de uma confirmação visual clara, um laboratório de pesquisa pode precisar de arquivos de imagem rastreáveis, exposição consistente e análise quantitativa de bandas.

Nunca remova a fonte de luz

Mesmo que as lâmpadas UV pareçam estar ligadas, elas começam a perder a saída com o tempo. Com a intensidade reduzida, o operador então aumentará o tempo de exposição, o que pode levar a menos consistência e maior exposição à amostra.

Siga as diretrizes de manutenção da lâmpada do fabricante. Um radiômetro UV seria uma medida mais objetiva do que a estimativa visual, e o UVP determinou que a medição de irradiância é um método apropriado para monitorar a vida útil de uma fonte UV.

Troque as lâmpadas conforme o conjunto, se recomendado, limpe cuidadosamente o filtro de visualização e anote as datas de manutenção. Lâmpadas fluorescentes UV também podem conter mercúrio e devem ser tratadas e descartadas como resíduos perigosos, conforme as necessidades locais.

Conclusão

Ao usar um transiluminador UV para visualização em gel, ele pode fazer isso rápida e claramente, mas não pode ser apenas brilhante em luz ultravioleta para obter bons resultados.

O comprimento de onda deve ser adequado para a coloração e para usos a jusante. A iluminação deve ser o mais uniforme possível, a exposição deve ser o mais curta possível, o filtro da câmera deve ser igual à fluorescência emitida, e o usuário deve estar protegido contra a exposição UV da fonte de luz.

O instrumento certo é aquele que acomoda o tamanho do gel, um método de coloração, os requisitos de imagem, o fluxo de trabalho para a recuperação das amostras e os controles de segurança para o ambiente do laboratório.

Perguntas frequentes

P1. Um transiluminador UV é usado para quê?

É usado principalmente para visualizar faixas de DNA, RNA ou proteína marcados fluorescentemente em géis de eletroforese. Também pode ser incorporado a um sistema de documentação em gel.

P2. Qual dos seguintes comprimentos de onda é comumente usado para géis de DNA?

Um uso comum da radiação UV de médios intervalos (próximo a 302 nm) é para visualização rotineira dos géis. A seleção final deve ser semelhante à do verniz, assim como à aplicação a jusante.

P3. A luz UV muta o DNA?

Sim. A exposição prolongada pode causar danos ao DNA e diminuir a clonabilidade do DNA e das aplicações posteriores.

P4. Qual é mais eficaz: Luz Azul ou Luz UV?

Se danos UV ao usuário e/ou danos ao DNA forem uma preocupação, o uso de luz azul é recomendado para manchas compatíveis. Mesmo para algumas manchas conhecidas, a radiação UV pode proporcionar uma excitação melhor.

P5. Por que há uma fraqueza nas GelBands?

Isso provavelmente se deve à baixa concentração da amostra, uma coloração inadequada, comprimento de onda ou filtro inadequados, lâmpadas envelhecidas, luz de fundo excessiva ou coloração ruim.