Receptor acoplado à proteína G: Da Sinalização Celular à Descoberta de Fármacos

Receptores acoplados à proteína G, ou GPCRs para abreviar, são proteínas de membrana que auxiliam as células a responderem a sinais vindos de fora das células. Esses sinais podem abranger hormônios, neurotransmissores, lipídios, peptídeos, bem como luz.

Embora haja uma clara comunalidade de estrutura na estrutura de sete transmembranas dos GPCRs, eles não funcionam da mesma maneira. Os resultados de um experimento podem depender do ligante do receptor, do ambiente da célula, do nível de expressão do receptor e dos parceiros de sinalização.

Os pesquisadores, então, precisam ir além dessa medição da "ativação" de um receptor por um composto para decifrar a biologia do GPCR. Todo o caminho, tempo, formato do ensaio, controles e modelo celular são importantes.

Receptor acoplado à proteína G: O que é isso?

O número de vezes que um GPCR típico atravessará a membrana celular é 7. As porções extracelulares se ligam às moléculas sinalizadoras e as porções intracelulares se ligam às proteínas G, arrestinas, quinases e outras moléculas sinalizadoras.

Os GPCRs são classificados em várias classes principais pelo Guia de Farmacologia da IUPHAR/BPS, como Classe A, Classe B, Classe C, Frizzled e receptores de aderência. A Classe A é a maior e envolve alvos bem conhecidos, como os receptores adrenérgicos, dopaminas, opioides e muscarânicos.

Embora semelhantes em estrutura, os GPCRs são capazes de reconhecer um conjunto muito diversificado de sinais. Isso permite que eles participem da percepção sensorial, regulação cardiovascular, metabolismo, funções imunológicas, humor, movimento e muito mais.

Como os GPCRs são ativados?

Um ligante se liga ao receptor e faz com que o receptor mude de forma. Como resultado dessa mudança conformacional, o receptor é capaz de interagir com uma proteína de sinalização intracelular.

Muitos GPCRs possuem uma proteína G heterotrimérica como primeiro parceiro composta por subunidades alfa, beta e gama. A ativação dos receptores resulta na troca de GDP por GTP na subunidade alfa. Os componentes ativados então afetam as enzimas a jusante, canais iônicos e segundos mensageiros.

As famílias mais populares de proteínas G são:

• Gs, que normalmente causa um aumento no AMP cíclico
• O nome comumente usado para a enzima redutora de AMP cíclico é gi/o.
• A via Gq/11 que sinaliza as vias da fosfolipase C e do cálcio
• As respostas da proteína e do citoesqueleto da família Rho podem ser controladas por G12/13.

Esta descrição do livro didático é útil, mas uma linha é uma forma rara de sinalização! Um único receptor pode sinalizar através de múltiplas proteínas G e a transdução ótima do sinal pode variar dependendo do ligante e do tipo celular. O GPCRdb menciona que receptores podem interagir com proteínas G, quinases GPCR e arrestinas, o que leva à formação de diversas vias de sinalização intracelular.

Os papéis dos detentores

Uma vez ativada a proteína G, a sinalização dos GPCRs não para.

As quinases GPCR são capazes de fosforilar receptores ativados. As arrestinas poderiam então interagir com o receptor, inibir o acoplamento adicional do receptor às proteínas G, facilitar a internalização do receptor e estar envolvidas em outras vias de transdução de sinais.

Portanto, o recrutamento de prisões não pode ser considerado um "interruptor de desligar". Dependendo do receptor e do experimento, pode afetar o tráfego, dessensibilização, reciclagem, degradação do receptor ou modular outros efeitos a jusante.

Como tanto a sinalização da proteína G quanto o recrutamento por arrestina são medidas importantes da farmacologia completa de um composto, elas são frequentemente medidas juntas.

Os artigos desta seção examinam as maneiras pelas quais o mesmo receptor pode levar a respostas diferentes

Os GPCRs não são apenas interruptores liga/desliga.

Diversos ligantes podem ser encontrados ligando-se a diferentes fases conformacionais do receptor. Um tipo de ligando pode causar altos níveis de ativação em uma via da proteína G, enquanto o outro pode causar maior recrutamento de arrestinas ou um perfil de sinalização diferente. É tipicamente referido como seletividade funcional/sinalização enviesada.

Os antecedentes das células também são importantes. O mesmo receptor pode ser encontrado em dois laboratórios diferentes, mas possui quantidades diferentes de proteínas G, arrestinas, quinases, enzimas ou receptores endógenos nas células.

Outro problema pode ser o nível de expressão dos receptores. A expressão excessiva pode potencializar as respostas a baixos níveis de atividade e/ou alterar preferências de acoplamento, além de levar a um agonista parcial com atividade mais forte na célula do que no tecido nativo.

Portanto, um resultado deve ser interpretado como indicação do comportamento de um sistema experimental completo e não apenas do receptor.

Selecione o ensaio com base na questão biológica

Nenhum ensaio GPCR pode responder todas as perguntas.

Ensaios cAMP

Receptores com proteínas G ou Gi normalmente são medidos usando cAMP. Uma resposta G pode levar a um aumento no cAMP e uma resposta Gi pode ser indicada pela inibição da produção estimulada de cAMP.

Esses ensaios são comumente usados em estudos de concentração-resposta, em estudos de caracterização de agonistas e em estudos de antagonistas. Em experimentos com antagonistas, uma concentração do agonista é tipicamente aplicada após a exposição do composto de teste às células.

Ensaios de Cálcio

Receptores acoplados a Gq podem ser estudados por ensaios intracelulares de cálcio. Eles podem fornecer uma leitura rápida e de alta cadência, mas a resposta pode ser curta em duração e muito dependente do manuseio das células, carga dos corantes, expressão dos receptores e momento da medição.

Ligação GTPγS

Os ensaios GTPγS são um dos primeiros eventos medidos no processo de ativação da proteína G e são frequentemente usados para confirmar a atividade do agonista em preparações de membrana. Como o ensaio está relativamente próximo da interação receptor–proteína G, ele pode reduzir um pouco a amplificação experimentada nas leituras a jusante.

Recrutamento por Prisão

Ensaios de arrestina podem ser usados para investigar viés de vias, sinais específicos de ligando, tráfico de receptores e dessensibilização de receptores. Eles são melhor usados em conjunto com um ensaio de proteína G e não como um indicador geral da ativação de um receptor.

Biossensores de Célula Viva

As técnicas BRET e FRET (e outros métodos de biossensor) podem rastrear eventos de sinalização em células vivas em função do tempo. O maior atrativo disso é a informação cinética: os pesquisadores conseguem medir quando a sinalização começa, quando ela atinge o pico e depois diminui, já que eles medem mais de um ponto final.

Faça um Experimento GPCR preciso

Um bom ensaio é baseado no biológico e não no instrumento.

Para começar, certifique-se de que o receptor esteja expresso e situado na posição correta da membrana celular. A baixa resposta pode não ser resultado da baixa atividade do ligante, mas sim de uma expressão/tráfego ruim dos receptores.

Em segundo lugar, adicione dispositivos de controle apropriados. Comumente, podem ser necessários um agonista conhecido, um antagonista conhecido, controles de veículos, células não transfectadas e um controle independente do receptor para o ensaio a jusante.

Por fim, execute uma curva concentração-resposta completa. Uma avaliação de apenas uma concentração de um composto não será uma medida confiável de potência, eficácia, agonismo parcial, toxicidade ou interferência não específica com um ensaio.

Também é necessária padronização do tempo. Quando você recebe um sinal de cálcio, em poucos segundos, e depois algumas horas depois mede a expressão gênica, não dá para simplesmente comparar os dois. Testes que medem o mesmo receptor podem ser usados para medir diferentes fases da resposta.

Por fim, valide resultados significativos usando abordagem ortogonal. Se um composto for encontrado ativo em um ensaio de cAMP, é melhor confirmá-lo com outro ensaio útil, ensaio de ligação ou com um controle positivo específico para receptores. O Manual de Orientação de Ensaio sugere que a validação cuidadosa, controle de qualidade e caracterização farmacológica dos resultados do GPCR na aproximação à otimização de leads serão recomendadas.

GPCRs para Descoberta de Medicamentos

Os GPCRs continuam sendo um papel fundamental na descoberta de fármacos, pois estão envolvidos em muitos aspectos da fisiologia e são expressos em superfície na célula. O GPCRdb estima que 25% dos hormônios humanos estão envolvidos em resposta a membros dessa família de receptores, e que aproximadamente 1/3 de todos os medicamentos têm como alvo membros dessa família de receptores.

Para programas tradicionais, os principais alvos da busca eram agonistas ou antagonistas que se ligavam ao local principal de ligação ao ligante. Investigação de moduladores alostéricos, ligantes enviesados por vias, seletividade receptor-transdutores, cinética de ligação e design de compostos baseados em estrutura também está atualmente em investigação.

Com o advento da biologia estrutural, isso se tornou mais viável. O GPCRdb agora inclui ferramentas para comparar locais de ligação e estados de ativação dos GPCRs, incluindo estruturas de receptores determinadas experimentalmente, complexos receptor–ligante e complexos proteicos receptor–G.

Um composto com boas estruturas deve ser submetido a testes funcionais mesmo com boas estruturas. Uma molécula pode se ligar a um alvo adequado com forte afinidade de ligação e não desencadear a resposta celular pretendida ou, alternativamente, uma molécula pode engajar a via desejada, mas não da maneira correta.

Conclusão

Os receptores acoplados à proteína G são melhor considerados não apenas como um interruptor de membrana, mas como um sistema de sinalização flexível.

O receptor muda de forma em resposta à ligação de um ligante, o receptor encontra seus parceiros na célula e o ambiente dita o curso do sinal. Por isso, é importante considerar a escolha dos ensaios, a expressão dos receptores, o momento do caminho, controles e validação ortogonal.

As melhores conclusões para pesquisas com GPCR e descoberta de medicamentos frequentemente são alcançadas como resultado de uma combinação de informações estruturais e mais de um ensaio funcional.

Perguntas frequentes

P1. Qual é a principal função de um GPCR?

Um GPCR é um receptor da superfície celular que responde a um sinal extracelular e produz uma resposta intracelular. A resposta pode estar via proteínas G, arrestinas, segundos mensageiros, canais iônicos ou regulação gênica.

P2. Todos os GPCRs são ativados pela mesma proteína G?

Não. Vários receptores podem preferir ativar diversas proteínas G (Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13 ou múltiplos parceiros de sinalização).

P3. O que é um GPCR órfão?

Um GPCR órfão é um receptor para o qual o ligante ativador natural não é certo. Esses receptores ainda têm grande importância para a pesquisa básica e o desenvolvimento de medicamentos.

P4. Então, qual ensaio usar para a triagem do GPCR?

O "melhor" ensaio dependerá da questão a ser tratada e da via de sinalização do receptor. Diferentes aspectos da resposta podem ser medidos por ensaios de cAMP, cálcio, GTPγS, arrestina e biossensores de células vivas.

P5. Qual é a razão para os pesquisadores empregarem mais de um ensaio?

Um ensaio pode medir apenas um caminho ou ter interferências específicas do formato. Se for possível demonstrar, com um ensaio ortogonal, que o efeito observado é realmente relacionado ao receptor, então é possível concluir que isso é realmente um efeito do receptor.