Disruptor Ultrassônico Programável: Construindo um Fluxo de Trabalho de Sonicação Repetível

Quando o laboratório exige mais controle do que o disponível em um homogeneizador portátil, um disruptor ultrassônico programável pode ser a resposta. Pode perturbar células, dispersar partículas, homogeneizar suspensões, cisalhar ácidos nucleicos ou preparar amostras para análise posterior.

O instrumento é fácil de usar. O desafio é encontrar condições que processem a amostra corretamente, sem que haja danos ao material que o laboratório deseja recuperar, e sem superaquecimento da amostra.

É aí que o controle programável se torna útil. O operador pode definir a amplitude e/ou o tempo de processamento, o ciclo de pulso, a temperatura limite ou a energia total sem segurar um botão e sem julgar o resultado pelo som. Após o estabelecimento de um método otimizado, as condições otimizadas podem ser repetidas para amostras subsequentes.

Como Funciona a Perturbação Ultrassônica

O disruptor ultrassônico é um aparelho que transforma a energia elétrica em vibração mecânica. Essa vibração é passada para uma sonda que é colocada na amostra líquida pelo conversor.

Quando a sonda se move em alta velocidade no líquido, são geradas mudanças de pressão que causam a formação de bolhas microscópicas de líquido. Essas bolhas crescem e encolhem e são chamadas de cavitação. As forças geradas na área local podem causar a ruptura das membranas celulares, a quebra dos agregados e permitir melhor mistura ou dispersão.

Em termos de uso prático, a sonda está aplicando uma quantidade enorme de energia mecânica em uma área pequena. Por isso, a sonicação da sonda pode ser rápida, mas também pode ser prejudicial a um alvo sensível ou causar espuma em um experimento.

Por que o controle programável importa

Duas amostras podem ser tratadas pelo mesmo período, mas não receberem o mesmo tratamento.

O movimento da energia ultrassônica através do líquido será afetado por: volume da amostra, viscosidade, temperatura, diâmetro da sonda, profundidade de imersão e formato do recipiente. O instrumento programável permite ao operador controlar as variáveis que podem ser padronizadas de forma realista.

Os processadores ultrassônicos modernos podem ter amplitude ajustável, operação temporizada, modo de pulso, exibição de energia, setpoints de energia e monitoramento de temperatura.

Essas funções não são apenas convenientes, mas também úteis. Eles tornam o método mais fácil de documentar e explicam exatamente como uma amostra foi processada.

O seguinte: "sonicado por um minuto." é um método inadequado. Deve especificar o tipo de sonda, a configuração para a amplitude, o ciclo do pulso, o tempo total de processamento, o volume da amostra, o método de controle de temperatura e o tipo de recipiente.

Use uma amplitude inicial, não uma potência máxima

Provavelmente o maior erro é pensar que mais watts = mais potência em cada amostra.

A amplitude é uma medida do movimento da ponta da sonda e está mais diretamente associada à intensidade da sonicação. A potência usada pelo instrumento variará dependendo da resistência gerada pela amostra, pela sonda, pela viscosidade e pelas condições de operação. Quando um método precisa ser reproduzido, é importante manter a amplitude, temperatura, viscosidade e volume da amostra iguais, diz Sonics.

Ao desenvolver métodos, comece com uma amplitude moderada e não use a amplitude mais alta no início. Faça uma pequena amostra de teste, olhe o resultado e aumente a intensidade do processo apenas se necessário.

A sonicação excessiva pode levar a uma melhor perturbação das células, mas também causar maior temperatura, espuma, desgaste da sonda e danos a proteínas ou estruturas celulares sensíveis.

A amplitude apropriada depende, portanto, da aplicação. A lise celular e/ou dispersão de nanopartículas, preparação de organelos e/ou cisalhamento do DNA não deve ser esperada como a mesma.

Controle o calor com o Modo Pulso

Com sonicação contínua, a temperatura da amostra pode ser aumentada rapidamente. Isso é importante ao usar proteínas, enzimas, estruturas de membrana ou outros materiais sensíveis à temperatura.

Métodos mecânicos de perturbação celular podem gerar aquecimento localizado, o que pode resultar na desnaturação ou agregação de proteínas. Portanto, a preservação da qualidade da amostra é importante se a qualidade da proteína deve ser preservada, e para esse fim a amostra deve ser mantida refrigerada.

O modo pulso é um ciclo entre sonicação e relaxamento. Em um ciclo desligado, a amostra recebe tempo para esfriar e se depositar ao redor da sonda antes da próxima explosão. A operação intermitente também é mencionada nos manuais de equipamentos para ajudar a reduzir o acúmulo de calor e, assim, aumentar a consistência no processamento.

O modo pulso não elimina a necessidade de controle de temperatura. Mesmo que os tubos sejam pequenos, eles podem aquecer rapidamente, especialmente em alta amplitude. Ainda pode ser necessário usar banho de gelo, suporte gelado, sonda de temperatura ou um corte de temperatura programado.

Certifique-se de que a sonda corresponda ao Volume da Amostra

Há uma influência significativa do tipo de sonda utilizada.

Uma pequena microponta acumula energia em um pequeno elemento que pode ser de alta intensidade em um ponto pequeno. Quanto mais potência você tiver, mais material maior será a sonda. Como visto nas instruções do fabricante, o diâmetro da sonda e o volume real de processamento são altamente correlacionados, mas a faixa final de valores depende do processo.

Uma sonda grande demais para uma amostra pequena pode respingar e/ou superaquecer. Uma ponta pequena em um recipiente grande pode causar o processamento desigual e causar um tempo de processamento desnecessariamente longo.

A sonda deve ser suficientemente profunda para transferir energia eficientemente para o líquido, mas não tão profunda a ponto de sugar ar demais para dentro da amostra. Durante a vibração, ele não deve entrar em contato com o fundo ou a lateral do recipiente.

O formato dos recipientes também é importante. Se um vaso estreito for usado para focar energia, ele pode focar energia de forma diferente de um béquer largo e usar um tubo ou recipiente diferente no mesmo estudo pode alterar o resultado, mesmo que as configurações do instrumento sejam as mesmas.

Construa o Método em Torno da Amostra – CSTA 2014, Seção 2, Grau 12, Trecho B, Tarefa 3

Normalmente, um método sólido para sonicação é encontrado após alguns breves testes.

Comece pelo tipo real de amostra, o tamanho da amostra, concentração, buffer e recipiente destinados a serem usados em análises rotineiras. Deve manter a amostra fria; Selecione uma sonda apropriada. Use amplitude média e pulsos breves.

Revise o resultado de cada ensaio usando um método que simule o objetivo real. Isso pode ser microscopia, rendimento de proteínas, atividade enzimática, viscosidade e/ou clarificação após a centrifugação. Pode incluir medição do tamanho das partículas e/ou estabilidade visual para dispersão de partículas.

Não avalie o sucesso com base no nível de turbidez ou clareza da amostra. A perda de atividade da proteína alvo pode ter ocorrido antes do aparecimento da amostra.

Após a determinação das condições aceitáveis, documente cuidadosamente as condições e repita o teste com várias amostras independentes. Não há maneira melhor de testar a confiabilidade de um método do que fazê-lo se repetir.

Materiais comuns usados no laboratório

Esse tipo de disruptores ultrassônicos programáveis é amplamente adotado nos seguintes campos:

• A perturbação da parede celular de bactérias e mamíferos. A quebra das paredes celulares bacterianas e mamíferas.
• O corte preliminar dos tecidos precisa ser seguido pela homogeneização tecidual. Os tecidos devem ser homogeneizados após o corte preliminar.
• Isso abrange os procedimentos necessários para preparar amostras de proteínas e ácidos nucleicos. A preparação da amostra de proteínas e ácidos nucleicos.
• Cisalhamento da cromatina por DNA ou cisalhamento da cromatina. Cisalhamento de DNA ou cromatina.
• Uma dispersão de partículas e nanopartículas.
• Emulsificação
• Desaglomeração
• Extração e mistura
• Dificuldade em preparar suspensões. Dificuldade em fazer suspensões difíceis.

Existem vários métodos físicos diferentes que podem ser usados para a lise celular, como a sonicação. A abordagem mais adequada variará conforme o tipo de célula, tamanho da amostra, aplicação a jusante e sensibilidade do material a ser extraído.

Se uma técnica de processamento de baixa intensidade ou outra técnica de perturbação for mais adequada para organelas delicadas ou proteínas facilmente destruídas, use essa técnica.

Existem problemas comuns de operação que você deve evitar

A espuma geralmente é causada pela sonda estar muito próxima da superfície do líquido e/ou pela amostra ser processada com muita intensidade. Uma leve descida da sonda, uma diminuição na amplitude ou uma mudança no ciclo do pulso podem ser úteis.

As razões para a baixa perturbação são que a amplitude é muito baixa, a sonda errada é usada, a amostra em excesso é usada, a amostra não está imersa na profundidade correta ou é muito curta em relação ao tempo total de processamento.

Às vezes, várias variáveis são alteradas para tornar os resultados inconsistentes. O método pode variar dependendo do tubo utilizado, da temperatura inicial da amostra, viscosidade, profundidade de penetração da sonda na amostra e volume.

Quando um ruído mecânico é ouvido ou é estranho, ele não deve ser ignorado. Pode ser sinal de sonda solta, ponta danificada ou desmontagem. O instrumento deve ser parado e verificado antes que o processamento adicional seja realizado.

As pontas das sondas também são erodidas pela erosão por cavitação. Se a superfície for danificada, a transferência de energia será efetuada e partículas metálicas podem ser introduzidas na amostra. Verifique a sonda com frequência e substitua conforme as instruções do fabricante.

Trabalhe com Segurança

Use suporte e grampo adequados para fixar o conversor, não deixe um conjunto instável.

No entanto, processadores de ultrassom produzem um som audível e as diretrizes do fabricante sugerem proteção auditiva durante o uso. Um recinto acústico proporciona uma redução de exposição e, além disso, contém respingos ou aerossóis.

Manuseie e conteça corretamente o material biológico e siga os procedimentos de segurança laboratoriais. O controle da profundidade da sonda deve ser feito para minimizar a formação de aerossóis e a formação de espuma. Enxágue entre as amostras e descontamine a sonda em um procedimento de enxágue apropriado, eficaz tanto para a sonda quanto para a amostra.

Conclusão

O resultado é afetado pela amplitude, pelo ciclo de pulsos, pelo tamanho da sonda, pelo volume da amostra, pela temperatura, pela profundidade da amostra dentro do recipiente e pelo formato do recipiente. O ritmo mais difícil não é um bom ponto de partida.

Um fluxo de trabalho confiável começa com testes breves e bem controlados, depois passa para um teste adequado a jusante para avaliar o resultado, e então informações suficientes são coletadas para que possam ser repetidas por outro operador.

Perguntas frequentes

P1. Para que serve o Disruptor Ultrassônico Programável?

Para lise celular, homogeneização, dispersão de partículas, cisalhamento de DNA, emulsão, extração e várias aplicações para processamento de líquidos.

P2. Amplitude Melhor e Maior?

Não. Um aumento na amplitude aumentará a intensidade da sonicação, porém pode resultar em aumento do aquecimento, espuma, desgaste da sonda e danos à amostra.

P3. Por que o Modo Pulso é usado?

Modo pulso: Períodos de descanso entre as rajadas ultrassônicas. Isso ajudará a reduzir o acúmulo de calor e a devolver o material ao redor da sonda.

P4. Qual é o tamanho ideal da sonda?

O volume, o tamanho do vaso amostral e a intensidade do processamento necessário devem ser todos correspondidos pela sonda. Ponteiras pequenas são boas para volumes pequenos e sondas grandes são boas para volumes grandes.

P5. Como tornar os resultados da sonicação reprodutíveis?

Sonda, amplitude, ciclo de pulso, volume, temperatura, profundidade de imersão, composição da amostra.