Kits de Fluorômetro: Um Guia Prático para Quantificação de Amostras Sensíveis

Em laboratórios de biologia molecular, DNA, RNA ou proteína podem ser medidos por meio de um kit de fluorômetro que utiliza fluorescência. Esses ensaios são baseados em corantes que apresentam um sinal mais alto quando ligados a um alvo específico, em vez de medir a absorção total do UV. Essa seletividade é vantajosa se as amostras forem diluídas, de pequeno volume ou contaminadas com outras substâncias que possam interferir nas medições de absorção.

Um fluxo de trabalho completo normalmente inclui um reagente de ensaio, tampão de diluição, padrões, tubos ou placas de ensaio, e um fluorômetro adequado para o procedimento. A amplitude do ensaio é fundamental para obter resultados confiáveis, assim como a consistência da preparação dos padrões, proteção contra exposição inadequada à luz dos reagentes e todas as diluições registradas com precisão.

Um kit de fluorômetro contém todos os materiais e suprimentos necessários para medir a fluorescência

A maioria dos kits de ensaio com fluorômetro consiste em um corante fluorescente altamente concentrado, um tampão de ensaio e padrões de referência. Tubos, cartões de protocolo ou configurações específicas de ensaio para instrumentos também estão incluídos em alguns kits.

A química do corante será o fator determinante para medir o ensaio. A quantificação seletiva de dsDNA deve ser realizada em um kit de DNA de fita dupla. Ensaios de RNA, DNA de fita simples e proteínas são baseados em diferentes químicas de ligação e não são intercambiáveis.

Um exemplo é que kits comerciais para dsDNA podem incluir um reagente concentrado para ensaio, tampão diluente e padrões de DNA pré-diluídos. Outros sistemas estão disponíveis que fornecem reagentes compatíveis com fluorômetros de tubo único ou microplacas com os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados.

Às vezes, a fluorescência é melhor do que a absorção UV

A estimativa da concentração de ácidos nucleicos por espectrofotometria UV baseia-se na absorvância a 260 nm. É rápido e útil para proporções de pureza, mas sais, nucleotídeos livres, proteínas, RNA, DNA e outros compostos orgânicos podem gerar um sinal de absorção.

Ensaios fluorescentes são criados para serem mais específicos para um analito selecionado. Isso pode ser útil para aumentar a precisão de uma baixa concentração ou amostra que pode conter potenciais poluentes. Assim, a quantificação fluorométrica pode ser mais sensível e seletiva do que a absorção UV para a medição de DNA, RNA ou proteína específica.

Ambos os métodos podem ser usados em combinação. A fluorescência pode ser usada para medir a concentração de um determinado alvo e a absorção UV pode fornecer uma medição de pureza mais geral.

Escolha o kit para o analito e a faixa de medição.

Existem vários tipos comuns de kits de fluorômetro disponíveis, tais como:

• Ensaios de DSDn de alta sensibilidade
• Ensaios de dsDNA de amplo alcance
• Ensaios de RNA
• Ensaios de ssDNA
• Ensaios de proteínas
• Ensaios de qualidade de RNA

Extratos de baixa concentração e bibliotecas de sequenciamento preparadas podem ser detectados por um ensaio de alta sensibilidade. Ensaios de faixa estreita são melhores para amostras de alta concentração. Amostras fora da faixa validada precisarão ser diluídas ou os resultados podem ser menos confiáveis.

Os intervalos de quantificação entre os kits de alta sensibilidade e de ampla faixa podem ser diferentes e ser para o mesmo analito. Portanto, o ensaio deve ser escolhido com base na concentração esperada, e não apenas com base no nome da amostra.

O kit precisa ser compatível com o fluorômetro também. Verifique os canais de excitação e emissão, formato do tubo/placa, volume da amostra, método de calibração e opções de ensaio programado. Protocolos específicos podem ser pré-programados em alguns fluorômetros para análise de dsDNA, RNA e ssDNA, outros podem ser programados sob medida.

Escreva as definições para Volume de Amostra e Throughput

Um volume pequeno é útil se amostras forem difíceis de obter ou exigirem preservação para experimentos posteriores. Alguns micrólitros de amostra são necessários em alguns sistemas fluorométricos de bancada, mas normalmente a amostra é colocada em um volume maior de solução de trabalho.

O rendimento também é um fator importante. Para medições ocasionais e pequenos lotes, um fluorômetro de tubo único pode ser apropriado. Um instrumento ou um fluxo de trabalho de microplacas que possa processar múltiplas amostras de extração ou várias bibliotecas de sequenciamento pode ser preferido para laboratórios com muitas amostras.

Nem todo instrumento é o mais prático. Um bom sistema deve minimizar a pipetagem repetitiva, facilitar a preparação regular e igualar a quantidade real de amostras que o laboratório irá manusear regularmente.

Seguir um fluxo de trabalho consistente de ensaio

O seguinte é um protocolo padrão de kits de fluorômetro:

• A. A solução funcional está pronta. Uma solução funcional é criada.
• Estabelecer os padrões necessários
• Adicionando cada amostra desconhecida
• Misturando samples e standards de forma minuciosa
• Incubação pelo tempo especificado
• Prevenção de reações causadas por exposição inadequada à luz
• Usando uma régua para medir a largura e o comprimento do cérebro.9. Medição correta do cérebro usando uma régua.
• Aplicação dos fatores de diluição das amostras

Use pipetas calibradas para preparar e utilize padrões e amostras da mesma forma. Se uma etapa de pipetagem for feita com baixo volume, um pequeno erro no volume pode fazer uma diferença significativa na concentração final.

O tempo necessário para a incubação também é importante. Coletar uma amostra no início e outra substancialmente depois pode causar variações desnecessárias. Alguns ensaios também são sensíveis à diferença de temperatura entre os padrões e as amostras.

Use standards, blanks e replicações adequadas

Padrões são usados para relacionar a quantidade de alito à intensidade de fluorescência. Devem ser bem misturados, devidamente rotulados e mantidos longe de contaminação.

Quando uma amostra desconhecida é inserida em um branco, o sinal medido é devido ao reagente, ao tampão, ao tubo ou à matriz da amostra de fundo. Medições replicadas são úteis se a amostra for valiosa, a concentração exata estiver próxima do limite do ensaio ou um resultado inesperado impactar um processo caro a jusante.

Se houver leituras duplicadas que discordam, não calcule apenas uma média das duas leituras. Verifique a precisão da pipeteação, mistura da amostras, presença de bolhas, limpeza do tubo, tempo de incubação, temperatura e a faixa de medição escolhida.

Homens e mulheres têm formas diferentes de medir a dor

Algumas das razões comuns para resultados fluorométricos pouco confiáveis são:

• A escolha do ensaio errado para o alvo
• Seleção de uma faixa de sensibilidade inadequada
• Não usar o recipiente correto para armazenamento e preparação
• Adição de volumes de amostras inconsistentes
• A presença de contaminantes nos padrões ou na solução de trabalho.
• A armadilha para deixar bolhas no caminho óptico.
• O uso de tubos riscados ou incompatíveis é proibido. Tubos riscados ou incompatíveis não são permitidos.
• Exposição excessiva a reagentes sensíveis à luz
• Não considere que o número de células em uma amostra é reduzido por diluição.
• Uso do dispositivo fora do alcance do dispositivo validado.

Amostras concentradas também podem contaminar pipetas ou áreas de trabalho, e impactar amostras futuras de baixa concentração. Isso é minimizado por ponteiras novas, superfícies de trabalho limpas e uma sequência racional de amostras.

Conecte a Medição ao Fluxo de Trabalho Downstream arrastando-a para o Fluxo de Trabalho Downstream

Kits de fluorômetro são frequentemente utilizados antes de PCR, qPCR, clonagem, preparação de biblioteca de sequenciamento, eletroforese, transfecção e outros fluxos de trabalho que envolvem entrada controlada de amostras.

A quantificação é importante para normalizar amostras, comparar o rendimento de extração e obter uma entrada consistente da reação. Ensaios de RNA (baseados em fluorescência) são aplicados antes de outras aplicações como RT-PCR e preparação de cDNA-library; A quantificação do DNA é aplicada em várias aplicações posteriores, como PCR, clonagem, transfecção e sequenciamento de próxima geração.

Portanto, a escolha do kit deve ser orientada para a decisão tomada após a medição. Um ensaio de ampla faixa pode ser usado durante uma verificação de extração rotineira, e um ensaio mais sensível para trabalhos de sequenciamento de baixa entrada.

Sempre mantenha e manuseie os reagentes adequadamente

Reagentes fluorescentes podem ser sensíveis à luz, temperatura e manuseio. Armazene, aqueça, misture e expire conforme as instruções do kit. Nem todos os corantes fluorescentes podem ser congelados, armazenados em temperatura ambiente ou expostos à luz do laboratório.

Marque claramente as soluções funcionais e lembre-se de registrar a data em que foram feitas. Antes de suspeitar que as amostras originais mudaram, verifique a idade do reagente, histórico de armazenamento dos reagentes, padrões, pipetas, ajuste do instrumento, temperatura e compatibilidade do tubo.

Conclusão

Kits de fluorômetro são sensíveis e seletivos para detectar a quantificação de DNA, RNA ou proteína, especialmente em amostras valiosas ou diluídas. A medição confiável exige que o ensaio seja adequado para o analito e a faixa de concentração, o uso de um fluorômetro adequado, a preparação consistente dos padrões e o controle de todo o processo.

Não é o kit com o menor limite de detecção declarado que é o melhor kit. É aquela que corresponde ao tipo de amostra, ao rendimento, à aplicação a jusante e aos requisitos de controle de qualidade do laboratório.

Perguntas frequentes

P1. Quais são as aplicações do Kit de Fluorômetro?

Existem vários kits diferentes disponíveis para testes de qualidade de dsDNA, ssDNA, RNA e alguns RNA. A química do método usado para a triagem deve ser adequada para o alvo.

P2. Quais são mais eficazes, kits de fluorômetro ou métodos UV?

Eles tendem a ser mais específicos e sensíveis a um analito específico. A absorção UV ainda pode ser considerada válida para testes semifinais de pureza e para medir a pureza geral da amostra.

P3. Quanta amostra você precisa?

Os volumes variam para cada ensaio e instrumento! De fato, existem muitos sistemas de bancada disponíveis, exigindo apenas alguns microlitros da amostra original.

P4. Qual é o reagente usado para testar RNA de DNA?

Geralmente não de forma seletiva. Na aplicação rotineira, pode-se querer medir o conteúdo de DNA e/ou RNA, e assim, um ensaio pode ser específico para um ou ambos.

P5. Qual é a causa da variação nos resultados de diferentes réplicas?

Essas situações são frequentemente causadas por erro de pipeteamento, mistura inadequada, bolhas, contaminação, temperatura ou erro de faixa de medição.