Sistema de Fragmentação de DNA Ultrasssônico: O que Torna o Corte de DNA Reprodutível?

Quebrar DNA não é grande coisa.

A parte importante é dividi-la em uma distribuição de fragmentos útil e repetível, de uma amostra para outra, de um dia para o outro.

Assim, a capacidade de cortar DNA genômico não deve ser o único critério usado para avaliar um sistema de fragmentação ultrassônica de DNA. Em vez disso, a questão para um laboratório NGS é se uma amostra pode ser claramente definida e colocada no instrumento hoje, na próxima semana ou nas mãos de outro laboratório, e ainda assim avançar para a preparação da biblioteca sem a necessidade de repensar todo o processo.

Em vez de ser um processo de sonicação independente, a fragmentação acústica controlada faz parte do processo de Longlight Cisalhamento de DNA/RNA fluxo de trabalho, que é projetado para a preparação de amostras NGS. Essa distinção pode ser útil ao projetar uma técnica que deve ser adaptada ao trabalho cotidiano de laboratório.

Sempre comece pelo Perfil de Fragmento e NÃO pela configuração de energia.

Não é objetivo do experimento ajustar o instrumento.

O objetivo é a população de DNA que é removida do tubo.

A definição do que é esperado a jusante do fluxo de trabalho da biblioteca é o primeiro ponto de partida e depois trabalhar de trás para frente até um protocolo acústico. Uma configuração que gera uma distribuição benéfica para um array de DNA não deve ser vista como um protocolo universal para outros arrays.

Isso é particularmente crítico no caso da transferência de métodos. É fácil duplicar um programa de sonicação de um experimento anterior e considerar o trabalho feito. Concentração da amostra, volume da amostra, condição do DNA, tipo de tubo e histórico de processamento fazem parte do método na prática.

Portanto, o sistema deve ser validado em torno da amostra real, e não de um número atraente, exibido na tela do medidor.

O DNA chega ao Sonicator com um passado.

O "DNA genômico" presente em dois tubos não é necessariamente uma entrada igual.

Pode-se incluir DNA de alto peso molecular proveniente de uma extração limpa. Outro pode ter passado por armazenamento, múltiplos manuseios ou um processo de purificação de armazenamento antes do início da fragmentação.

Isso é importante porque o passo de tosquia é um passo do meio em um degrau maior.

Os laboratórios devem primeiro identificar variáveis controláveis (volume da amostra, faixa de concentração do DNA, tipo de recipiente, condição de temperatura e protocolo de manuseio) antes de otimizar um protocolo de fragmentação ultrassônica do DNA. Caso contrário, a falha pode se manifestar vários passos a montante como um aparente problema de instrumento.

Em quase todos os casos de ultrassom focado, a energia é aplicada ao alvo.

O método tradicional de sonicação tende a fazer com que os pesquisadores considerem principalmente a quantidade de ultrassom produzido. A outra questão sobre ultrasonicação focada é: Para onde essa energia acústica está indo?

Os sistemas BoFU da Longlight não exigem a inserção de uma sonda na amostra biológica, mas sim aspectos de energia acústica focada dentro de um meio acústico. Utiliza processamento sem contato e controle integrado de temperatura, Ultrassônico Focalizado BoFU-100 diz-se que foi projetado para cisalhamento de DNA, RNA e cromatina, e fragmentação do genoma, para NGS.

Esse arranjo fechado e sem contato é conveniente para a fragmentação do DNA, pois a amostra não requer contato direto com uma sonda de sonicação. Também minimiza as variáveis de contato da amostra e a limpeza que, de outra forma, seriam incorporadas ao protocolo.

Não é necessariamente "mais ultrassom".

É uma entrega de ultrassom mais controlada.

A temperatura faz parte do Método de Fragmentação!

O calor é um fator fácil de ignorar porque não é uma variável separada no último arquivo de sequenciamento.

As condições térmicas, durante a sonicação, entretanto, fazem parte do ambiente de processamento da amostra. Se o histórico de temperatura for diferente para uma execução em relação à outra, então o protocolo está sendo reproduzido de forma diferente.

Por isso é importante pensar no gerenciamento de temperatura mais cedo no processo de projeto, antes da acústica, e não como um equipamento.

Os projetos de ultrasonicadores focados da Longlight incluem processamento de amostras a baixa temperatura e temperatura constante e sensoriamento integrado para controlar o calor gerado durante o tratamento com ultrasonicador.

Para o desenvolvimento de métodos, isto é, registrar condições relacionadas à temperatura, tão seriamente quanto o próprio programa de sonicação.

O que significa "Reproduzível" com Throughput?

O que funciona bem com um tubo será complicado se 20 ou 40 amostras chegarem antes do almoço.

Então, nesse ponto, é mais uma questão de throughput.

As amostras podem ser armazenadas por tempos variados antes do processamento. As configurações podiam ser inseridas várias vezes pelos operadores. Podem haver variações entre os tipos de espécimes. Esse tipo de fluxo de trabalho, no qual há muito trabalho manual e repetitivo, pode causar variação mesmo que a tecnologia acústica em si seja estável.

Longlight's Ultrasonicador Focado BoFU-800 tem a capacidade de processar entre 1 e 8 amostras, com condições que podem ser otimizadas e configurações de lote que podem ser aplicadas se múltiplas amostras estiverem sendo processadas simultaneamente.

O Ultrassônico Focalizado BoFU-1600 é projetado para lidar com amostras em lotes maiores, com 16 posições de amostra e a capacidade de processar individualmente ou em lote.

A questão principal sobre compras é, portanto: "Qual sistema tem mais posições?"

Ou seja, "quantas amostras realmente são processadas juntas e com que frequência essas amostras exigem protocolos diferentes?"

Observe mais do que o tamanho médio dos fragmentos

Uma amostra bem-sucedida de DNA não garante um fluxo de trabalho de fragmentação de DNA bem-sucedido.

Uma execução de validação não deve ser a execução mais limpa, mas sim replicações e lotes por span. Os cientistas devem considerar se a distribuição de fragmentos ainda é adequada, se há caudas incomuns ou se a distribuição de fragmentos se torna mais ampla, e se a preparação da biblioteca a jusante funciona de forma consistente.

Esse também é o ponto em que o laboratório deve decidir como a qualidade dos fragmentos será rotineiramente verificada.

A controle de qualidade é realizada apenas durante o desenvolvimento do método e não é usada para processamento rotineiro; pequenas mudanças podem se acumular antes que alguém consiga detectá-las.

A intenção não é demonstrar a capacidade do sonicador de fragmentar DNA uma única vez.

A ideia é criar um processo que seja repetível.

Selecione o instrumento ao redor da bancada, não ao redor do folheto.

Cada laboratório terá seu próprio fator limitante.

Um pequeno grupo de pesquisa que faz algumas amostras de DNA, RNA ou cromatina ocasionalmente pode apreciar um fluxo de trabalho integrado e pequeno. Um laboratório de sequenciamento que realiza múltiplas amostras simultaneamente pode estar mais interessado em processamento paralelo. Pode exigir mais produtividade e configurações repetíveis/rastreáveis entre os operadores dentro de uma instalação central.

Por essa razão, não é possível selecionar o sistema certo apenas com base na tecnologia acústica.

Segundo o próprio Longlight FAQ sobre ultrasonicadores focados, em vez de apenas escolher uma especificação, considere fatores como controle acústico-energético, consistência do tamanho dos fragmentos, vazão, compatibilidade dos tubos, manutenção, orçamento de serviço e orçamento de laboratório.

Verificação Final de Validação

Antes de incorporar um sistema de fragmentação de DNA ultrassônico ao seu protocolo normal de preparação de NGS, faça algumas perguntas práticas.

É possível obter o perfil desejado de fragmentos em laboratório em mais de uma amostra? Existem condições de entrada especificadas? A temperatura é controlada? O formato do tubo/amostra é apropriado para o protocolo? É possível alcançar maior débito sem introduzir nenhuma variação manual supérflua?

Se as respostas para essas perguntas forem óbvias, então a etapa de sonicação para criar um genoma fragmentado não é mais tanto uma etapa de sonicação independente, mas mais sobre o que ela deveria ser: uma transferência controlada para a preparação da biblioteca.

FAQ

P1. O que é um sistema de fragmentação de DNA ultrasônico?

Ela corta mecanicamente o DNA em fragmentos menores, com energia acústica controlada, para uso em fluxos de trabalho, incluindo a preparação de bibliotecas NGS. Essa energia pode ser transmitida por um sistema focado via meio acústico sem precisar tocar a amostra com a sonda.

P2. A fragmentação do DNA NGS pode ser feita com ultrasonicação focada?

Sim. De acordo com uma lista publicada pela Longlight, a fragmentação genômica para NGS é uma das aplicações dos sistemas ultrasonicadores focados em BoFU da Longlight. Ainda existem algumas condições de protocolo a serem otimizadas para a amostra e o fluxo específicos.

P3. Mais potência ultrassônica significa melhor?

Não. O objetivo não é necessariamente a energia acústica máxima, mas sim a distribuição reprodutível de fragmentos que pode ser usada para processamento posterior a jusante. As configurações devem depender da condição da amostra e do protocolo.

P4. Por que é importante controlar a temperatura durante o corte do DNA?

A natureza do processo ultrassônico é que o calor será gerado, tornando a temperatura um parâmetro de processamento. A condição térmica controlada é importante para manter as sequências comparáveis quando repetidas usando o mesmo método de fragmentação.

P5. Qual dos vários sistemas de throughput eu devo escolher?

Comece considerando o número de amostras que normalmente são processadas ao mesmo tempo e se as amostras precisam ser processadas sob as mesmas ou diferentes condições. O BoFU-800 pode acomodar 1–8 processamento de amostras e o BoFU-1600 possui 16 posições de amostra para fluxos de trabalho maiores.