Buffer de Eletroforese Ultra-Rápido: Gels de DNA mais rápidos sem perder clareza

Embora a eletroforese em gel de agarose seja simples e confiável, o tempo para a eletroforese convencional às vezes é um fator limitante em um laboratório movimentado de biologia molecular. Se um laboratório realiza várias reações de PCR, digestões de restrição ou clonagem de amostras por dia, uma corrida de 30 minutos pode se tornar um gargalo significativo quando múltiplos géis são processados por dia.

Um buffer de eletroforese ultra-rápido é formulado com menor força iônica, o que reduz a condutividade e a corrente em uma determinada intensidade de campo elétrico e, portanto, limita o aquecimento em Joule. Isso permite o uso de intensidades de campo maiores sob condições validadas, reduzindo o tempo de separação enquanto mantém uma útil resolução de bandas.

Ultra Rápido Electrophoresis Buffer — O que é?

Um tampão de eletroforese ultrarrápida é um tampão de eletroforese de baixa força iônica otimizado para a rápida separação de fragmentos de DNA em géis de agarosa. Fornece os íons necessários para a condutividade elétrica e para condições químicas durante a migração.

A força iônica desse buffer é menor do que a da maioria dos buffers tradicionais, então menos calor é criado em uma determinada condição de operação devido à corrente. Isso pode permitir o uso de um gradiente de tensão maior no laboratório e encurtar o tempo de funcionamento.

Longlight's Buffer de execução super rápida 50X é fornecido como uma solução concentrada e reduz o tempo de separação dos típicos 30 minutos para cerca de 5-10 minutos, dependendo das condições recomendadas.

O motivo Inferior A força iônica pode aumentar a velocidade de corrida?

O DNA tem carga negativa e migra em direção ao eletrodo positivo em um campo elétrico. Quanto maior o campo elétrico, mais rápido o DNA viaja, embora os buffers convencionais possam produzir calor significativo em campo elétrico alto.

O superaquecimento pode causar o derretimento da agarose, levando a faixas curvas, faixas curvas ou danos ao equipamento de eletroforese. Um tampão de baixa força iônica resulta em menos corrente; menos calor é gerado, tornando mais viável operar em tensão mais alta.

Isso não quer dizer que a voltagem possa ser aumentada indefinidamente. As dimensões do gel, a profundidade do tampão, o design da câmara e a temperatura ambiente e capacidade da fonte de energia continuam a afetar o funcionamento.

Will Faster Electrophoresis resultar em menos resolução?

Quando o buffer, a concentração de agarose, a voltagem e a distância da passagem são apropriados à amostra, uma boa separação pode ser alcançada com uma corrida rápida. As condições normalmente não são verificadas quando um método é transferido, o que resulta em baixa resolução.

Para que os fragmentos se separem, eles devem ter distância de migração suficiente se estiverem próximos em tamanho. Se a passagem for interrompida muito cedo, podem ser comprimidos, mesmo que o corante de rastreamento tenha se movido próximo aos poços.

É importante que os laboratórios reconheçam a diferença entre uma análise para determinar presença ou ausência e um gel analítico de alta resolução. O primeiro pode precisar de um tempo de gel mais curto, e o segundo pode exigir um tempo de gel mais longo ou uma voltagem ligeiramente menor.

Como preparar um buffer funcional 1X a partir de um concentrado 50X?

Concentrado 50X deve ser diluído até obter uma solução de trabalho 1X. Por exemplo, para fazer 1 L de tampão de trabalho 1X, misture 20mL de concentrado 50X com 980ml de água destilada ou desmineralizada.

Agite bem antes de fundir ou encher a câmara. Para a preparação do gel de agarose e para o tanque de funcionamento, use a mesma preparação 1X para manter a consistência na condutividade do sistema.

Não dilua o buffer abaixo da concentração de trabalho recomendada para reduzir ainda mais a corrente. Buffering fraco e/ou padrões de bandas inconsistentes podem resultar de concentração incorreta, o que pode levar a migração anormal.

Qual é o Correto Voltagem para ajustar?

A voltagem deve ser determinada pelo comprimento efetivo do gel, e não apenas selecionada de um setup familiar em uma fonte de alimentação. Longlight recomenda o uso de cerca de 25–30 V/cm de comprimento de gel com seu buffer de funcionamento rápido.

Mas a configuração final também deve levar em consideração a câmara de eletroforese e o tipo de temperatura do gel e do tampão. A voltagem final também deve levar em conta o comprimento do gel, a carga da amostra, o design da câmara e a temperatura do tampão.

A fonte de alimentação precisa ser estável na saída na configuração desejada. O Fonte de energia por eletroforese EP-600 fabricado pela Longlight foi projetado para fornecer uma fonte estável de energia por eletroforese para o laboratório.

Que Gel Condições Não mudaram?

O tampão não pode superar o uso de uma concentração de agarose que não seja adequada. A menor concentração de agarose tenderá a suportar os fragmentos de maior peso molecular, e quanto maior a concentração de agarose, melhor será a separação dos fragmentos menores de DNA.

A espessura do gel também é importante. Géis espessos podem demorar mais para tingir e podem ter mais calor. Limpeza da formação dos poços e carregamento de amostras sem danificar as bordas.

Uma câmara horizontal compatível permite equalizar as condições elétricas. O Sistema de Gel Horizontal HE-50 é compatível com múltiplos sistemas de gel e apresenta um design de câmara de baixo consumo de tampão.

Quais métodos de coloração e visualização usar para o DNA?

Dependendo do produto e do protocolo, uma coloração de ácido nucleico pode ser incorporada durante a preparação do gel ou pode ser aplicada após a eletroforese. Ao comparar um tampão rápido com um método de coloração existente, o método de coloração deve ser o mesmo.

Tiragens muito curtas podem afetar a percepção da intensidade da coloração, especialmente se as faixas forem curtas. É importante ajustar a exposição, assim, como consequência do acima, não copiar a exposição automática de uma corrida convencional.

LongLight's RedView Mancha de ácido nucleico pode ser usado para visualizar DNA e RNA em géis de agarosa e poliacrilamida e funciona com equipamentos comuns de imagem.

É mesmo? Possível para recuperar DNA após uma rápida corrida?

Sim, desde que o buffer e a coloração não tenham efeito na extração do gel e nas reações a jusante. Segundo Longlight, 50X Super Fast Running Buffer não afeta a extração ou ligação do gel de DNA.

Minimize exposições desnecessárias à luz UV e remova o menor corte de gel possível para melhor recuperação. A faixa deve ser mantida separada para que fique distinta o suficiente para que nenhum produto vizinho seja incluído.

Quando a validação de um método for para clonagem, sequenciamento ou outro processo sensível a jusante, avalie o rendimento, pureza e desempenho do DNA recuperado.

Quando mudar o buffer de corrida?

Alguns buffers podem ser reutilizados, mas o reuso deve ser controlado e não apenas com base na aparência. Com execuções repetidas, temperatura, distribuição de íons e desempenho do buffer podem ser alterados.

Se a migração for desacelerada, as faixas não estiverem do formato esperado ou a solução ficar contaminada, substitua o buffer. Outro motivo para esse ser um bom momento para verificar o buffer é que a temperatura ambiente está alta, e após execuções mais rápidas seguidas.

Se a amostra for importante ou tiver baixa entrada, recomenda-se o uso de um novo buffer funcional para evitar variações desnecessárias.

Quais são os passos corretos para o Laboratório validar o Switch?

Use uma escada de DNA conhecida e amostras. Use a mesma concentração de gel, volume de amostras e método de coloração no tampão existente e no tampão ultra-rápido e execute tudo em paralelo.

Iguale o tempo de execução, formato da banda, separação dos fragmentos próximos e consistência de migração e qualidade da imagem. Quando a extração em gel estiver envolvida no fluxo de trabalho, avalie também o rendimento da extração em gel e de uma reação a jusante.

Uma vez aceitos, documente a diluição, o gradiente de tensão, o tamanho do gel, o comprimento da passagem e como o gel foi tingido e quantas vezes o buffer foi usado. Longlights reagentes gerais e consumíveis são projetados para facilitar aplicações regulares em genômica e biologia molecular.

Conclusão

O buffer de eletroforese ultra-rápido pode transformar a análise em gel de agarose em uma verificação de qualidade rápida. A vantagem é que permite uma menor resistência iônica e, ainda assim, uma maior intensidade de campo elétrico utilizável.

No entanto, todos os aspectos da preparação 1X, ajuste de gel e correção de tampões, concentração de agarose e controle de temperatura ainda são cruciais para garantir resultados confiáveis. Uma validação curta lado a lado permite que os laboratórios reduzam o tempo de funcionamento sem sacrificar a separação de bandas interpretáveis.

FAQ

Q1. Um buffer de eletroforese ultra rápido pode ser usado com um gel de DNA?

Sim. Projetado para separação rápida do DNA em gel de agarose. Recomenda-se que os usuários verifiquem a compatibilidade da câmara do gel, da coloração e do fluxo de trabalho a jusante.

Q2. O buffer 50X está pronto para uso?

Não. Um concentrado 50X deve ser diluído a 1X antes da preparação em gel ou da eletroforese. Usar o concentrado diretamente resultaria em força iônica e condutividade excessivamente altas, levando a uma geração excessiva de corrente e calor durante a eletroforese.

Q3. O mesmo buffer é usado para a fundição e para passar o gel?

Sim, o mesmo lote de buffer funcional 1X é recomendado para ambos. Isso ajuda a manter a força do buffer em todo o sistema de gel.

Q4. O gel esquenta se a voltagem for aumentada?

Pode, se não for buffer adequadamente, as condições de voltagem ou câmara não são adequadas. Para múltiplas execuções e/ou laboratórios quentes, monitore a temperatura do buffer.

Q5. É possível recuperar DNA de uma separação eletroforética rápida para ligação?

Sim, se forem usados um colorante e um tampão adequados. A validação inicial do laboratório deve abranger recuperação e desempenho de ligadura.