Fragmentador Gênico Ultrasônico: Um Guia Prático para o Cisalhamento Controle do DNA

Encurtar o DNA não é a única etapa que deve ser seguida para preparar os ácidos nucleicos para sequenciamento. O tamanho dos fragmentos deve estar dentro de uma faixa útil, adequado para as reações a jusante e ter variação limitada entre as amostras.

O princípio de como um fragmentador de genes ultrassônico (mais propriamente chamado de fragmentador ultrassônico de DNA ou ultrasonicador focado) funciona é quebrar moléculas longas de DNA em fragmentos mais curtos, usando energia acústica para isso. Com o controle tanto da entrega de energia quanto do tempo e da temperatura, o processo pode permitir fluxos de trabalho reprodutíveis de NGS e cromatina sem introduzir nenhuma clivagem específica para a sequência.

Que é um Fragmentador Gênico Ultrasônico?

Um fragmentador de genes ultrassônico é um tipo de instrumento usado em laboratório para transmitir a energia ultrassônica ao espécime biológico. Oscilações de pressão e forças mecânicas relacionadas à cavitação cortam o DNA em fragmentos menores.

O instrumento não pode detectar ou remover genes específicos. A quebra do DNA por ultrassom geralmente é aleatória, diferente da obtida por enzimas de restrição ou nucleases programáveis. Frequentemente, o objetivo é uma certa distribuição de fragmentos, em vez de uma sequência específica de nucleotídeos.

O Ultrasonicador focado BoFU-100 é especificamente otimizado para cisalhamento de DNA, RNA e cromatina, fragmentação do genoma e perturbação de amostras biológicas por Longlight.

Como Focado Trabalho de ultrassonação?

Os sonadores de sonda fornecem energia através de uma sonda imersa diretamente na amostra. O desempenho pode variar conforme a profundidade de imersão, condição da sonda e técnica do operador, enquanto o contato direto também introduz preocupações com limpeza e contaminação cruzada.

Um ultrasonicador focado é um dispositivo que foca a energia sonora através de um meio de acoplamento para um tubo de amostra fechado. A amostra é submetida a energia controlada e não há contato direto entre a fonte acústica do instrumento e a amostra biológica.

Parâmetros de processamento, como tempo de tratamento, intensidade acústica, ciclo de trabalho e temperatura, são usados para definir as condições de processamento. Essas variáveis afetam a distribuição final dos fragmentos e, portanto, devem ser otimizadas como um método completo e não ajustadas isoladamente sem verificação.

Por que Temperatura O controle é importante?

O tratamento ultrassônico envolve a criação de calor. Aumentos excessivos de temperatura da amostra podem levar a uma diminuição da qualidade dos ácidos nucleicos e à distribuição final dos fragmentos menos previsíveis.

Um sistema de resfriamento integrado ajuda a manter um ambiente de processamento mais estável. Isso é particularmente valioso para trabalhar com amostras de baixa entrada, cromatina sensível e para múltiplas execuções sequenciais.

O resfriamento não elimina a necessidade de controle do método. Mesmo com resfriamento ativo, volume de amostra, tipo de válvula, temperatura inicial e tempo de processamento devem permanecer consistentes porque influenciam a transferência acústica de energia.

Quais são algumas das aplicações da fragmentação ultrasônica?

Uma das principais aplicações é a preparação de bibliotecas NGS. Reparo final, ligação de adaptadores, amplificação ou outras etapas para construir a biblioteca são realizadas em um DNA genômico fragmentado. A faixa de tamanho desejada variará dependendo da plataforma de sequenciamento e protocolo usados na biblioteca.

A sonicação também é necessária para cisalhar a cromatina reticulada nos processos de imunoprecipitação da cromatina. A intenção é gerar fragmentos, que podem ser imunoprecipitados, que contenham interações relevantes DNA-proteína.

Outras aplicações podem ser para fragmentação de RNA, processamento de amostras FFPE, para processos de desorganização e extração celular e tecidular. Longlights Soluções de Aplicação de Genômica inclui instrumentos NGS e produtos laboratoriais.

Quais fatores Controle o Tamanho Supremo do Fragmento?

O tamanho do fragmento depende da energia acústica, tempo de tratamento, volume da amostra, concentração de ácidos nucleicos, geometria e temperatura do tubo.

Aumentar a energia acústica ou o tempo de tratamento não necessariamente produz uma diminuição proporcional no tamanho do fragmento. À medida que o DNA se torna mais curto, a cinética da fragmentação muda, e o processamento excessivo pode reduzir a recuperação ou comprometer a qualidade da amostra.

Um protocolo inicial deve, portanto, ser considerado um ponto de partida recomendado, em vez de uma configuração universal. Se o tipo de amostra for variado ou o tubo ou volume da amostra for alterado, o método deve ser refeito com um sistema de análise de fragmentos apropriado.

Como escolher Throughput?

Um único instrumento de amostra pode ser adequado para pesquisa de baixo volume ou desenvolvimento de métodos, ou para laboratórios com métodos flutuantes. Oferece flexibilidade ao pesquisador caso as amostras não possam ser processadas todas de uma vez.

Para laboratórios que processam regularmente conjuntos de amostras maiores, sistemas multi-posição podem ser mais adequados. O Ultrasonicador multicanal focado BoFU-800 é capaz de processar de 1 a 8 amostras e oferece modos de processamento individuais e em lote.

Não considere apenas o número de posições de tubos como medida de maior rendimento. Outros fatores que os compradores também devem considerar são tempo de processamento, trabalho de configuração, gerenciamento de parâmetros, rastreabilidade de amostras e se todas as posições podem alcançar os mesmos resultados de fragmentação.

Outro fluxo de trabalho é o Sistema multicanal BoFU-1600, que é adequada para requisitos de lotes maiores.

Por que os tubos existem e Volume de amostras importante?

O tubo de amostra é usado como um sistema acústico. O material de que ele é composto, a espessura das paredes, o formato e a posição em que está localizado são todos fatores que determinam como a energia ultrassônica é entregue ao líquido.

Os parâmetros do instrumento podem não ser os mesmos se for usado um tubo não validado, o que impactará o desempenho da fragmentação. Tubos fechados também minimizam a formação de aerossóis e a contaminação cruzada no processamento da amostras.

O volume de trabalho deve permanecer dentro do volume recomendado para o tubo selecionado. Volumes de preenchimento que são muito baixos ou inconsistentes podem alterar o foco acústico e podem ter uma repetibilidade reduzida dos resultados.

Como é que um Fragmentação Método validado?

O material representativo da amostra é o ponto de partida para iniciar a validação do método. Use os parâmetros sugeridos de válvula, volume, concentração e acústica para várias replicações.

Avalie a distribuição do tamanho dos fragmentos, os rendimentos de recuperação e o desempenho da biblioteca a jusante. No entanto, o tamanho médio do fragmento não é suficiente – Uma cauda de alto peso molecular pode indicar subfragmentação, enquanto uma fração excessivamente baixa de peso molecular pode indicar processamento excessivo ou degradação pré-existente do DNA.

Uma vez escolhido um método, estabeleça limites aceitáveis e documente o programa do instrumento. Controles rotineiros são usados pelos laboratórios para alertá-los sobre mudanças na qualidade da amostra, consumíveis ou condição do instrumento.

O que é isso Compradores Devo comparar entre os instrumentos?

Compare as faixas de fragmentos que podem ser alcançadas, volumes de amostras, formatos de válvulas, método de controle de temperatura e número de posições para processamento. Esteja atento também às necessidades de armazenamento de protocolos, registro, calibração e manutenção.

Solicite informações de aplicação aos fornecedores a partir de uma amostra semelhante à sua. Os resultados das demonstrações devem avaliar a repetibilidade dos tubos, a repetibilidade das posições e a repetibilidade de lotes de execuções, não apenas uma execução bem-sucedida.

A disponibilidade de consumíveis e suporte técnico também são cruciais. Um instrumento que depende de consumíveis difíceis de encontrar pode causar atrasos no fluxo de trabalho. Entre em contato com o Longlight Equipe de contato para alinhar as configurações e consumíveis BoFU às necessidades particulares do processamento da amostra.

Conclusão

A aplicação mais útil de um fragmentador de genes ultrassônico é tornar o cisalhamento de DNA ou cromatina um processo controlável e repetível! Um ultrasonicador focado pode tornar o cisalhamento de DNA ou cromatina um processo mais controlável e reprodutível quando a entrega de energia, temperatura, formato de tubo e condições da amostra são devidamente padronizados.

É importante escolher a ferramenta certa em relação às amostras reais no laboratório e ao trabalho ou fluxo de trabalho subsequente. Após a instalação do equipamento, é importante seguir o protocolo exato para garantir que as bibliotecas estejam consistentemente boas.

FAQ

Q1. Um fragmentador de genes ultrassônico corta sequências específicas de DNA ou corta DNA de forma em grande parte independente da sequência?

Não, a fragmentação que ocorre com energia ultrassônica será fragmentação mecânica aleatória. Enzimas ou sistemas de nucleases programáveis são necessários para cortar uma sequência específica.

Q2. As mesmas configurações devem ser usadas para todas as amostras de DNA?

Nem sempre. Mudanças no comportamento da fragmentação podem ocorrer em função do tipo de tubos usados e do volume e concentração de DNA, bem como da qualidade do material inicial; novas condições da amostra devem ser confirmadas.

Q3. A NGS pode ser feita com ultrasonicação focada?

Sim. Era popularmente usado para distribuição controlada de tamanhos de fragmentos de DNA para preparação de bibliotecas NGS. O alvo deve ser o mesmo do protocolo da biblioteca selecionado.

Q4. Qual é o benefício dos tubos de amostra fechados?

Tubos fechados minimizam o contato direto com amostras e minimizam a formação e contaminação de aerossóis. Eles também oferecem uma geometria controlada para permitir uma transferência regular de energia acústica.

Q5. Como devem ser feitas verificações dos resultados da fragmentação?

Analise a distribuição de tamanho total por um método apropriado de eletroforese ou análise de fragmentos. Esses também devem ser verificados quanto ao rendimento e desempenho da recuperação da biblioteca a jusante.