Cisalhamento de Cromatina: Como Construir um Fluxo de Trabalho Reproduzível de ChIP

O corte da cromatina é uma das etapas mais sensíveis em um protocolo ChIP. Fragmentos muito grandes podem levar a uma diminuição da resolução e a uma imunoprecipitação ruim. Cisalhamento de intensidade muito alta pode levar a danos ao epítopo, complexo DNA–proteína e material recuperável.

Nenhum programa único funcionará para todas as amostras. A resposta da cromatina à energia ultrassônica varia de acordo com cada tipo de célula, fixação, material inicial e dependendo da eficiência da lise da cromatina e do volume da amostra. Todo o processo de preparação deve ser controlado para obter resultados confiáveis, em vez de apenas alterar o tempo de sonicação.

O que é Cisalhamento de Cromatina?

Antes da imunoprecipitação, o cisalhamento da cromatina quebra a cromatina reticulada em fragmentos menores de DNA – proteína. Os anticorpos podem então ser usados para enriquecer a cromatina associada a um fator de transcrição específico, histona ou modificação de histona.

Após a imunoprecipitação, as ligações cruzadas são invertidas, o DNA é purificado e regiões enriquecidas são analisadas por qPCR ou sequenciamento. Longlights Soluções ChIP-seq fornecer assistência no estudo das interações proteína–DNA e dos sítios reguladores genômicos em todo o corpo.

O cisalhamento da cromatina difere da fragmentação de DNA purificado porque nucleossomos, proteínas associadas e ligações cruzadas de formaldeído alteram o acesso ao DNA e as propriedades mecânicas.

Por que o Fragment é Tamanho importante?

Fragmentos grandes diminuem a resolução posicional porque o DNA recuperado pode ser muito mais longo que o local de ligação à proteína. Eles também podem aumentar o fundo quando há regiões ao redor que não são específicas, mas ainda assim fisicamente conectadas.

Não presuma que peças muito curtas são necessariamente melhores. Uma quantidade excessiva de processamento pode levar à perda de rendimento da imunoprecipitação, perda de epítopos sensíveis ou a um perfil de biblioteca inadequado.

O tamanho ideal do fragmento variará com base no protocolo ChIP, alvo biológico, anticorpo utilizado e análise posterior. Portanto, os laboratórios devem estabelecer uma distribuição aceitável para seu próprio ensaio e não apenas um tamanho médio universal.

E quanto a Cisalhamento com reticulação?

A reticulação mantém a interação proteína-DNA, enquanto a reticulação muito intensa pode dificultar a fragmentação da cromatina e pode obscurecer os epítopos dos anticorpos. Interações fracas ou transitórias podem ser perdidas devido à fixação insuficiente.

O tempo de fixação varia conforme o tipo de amostra, a concentração dos reagentes, a densidade celular e a proteína alvo. A têmpera também deve ser uniforme, pois o comportamento das amostras mudará com a reticulação adicional.

Se a amostra continuar resistindo ao cisalhamento apesar do aumento da energia acústica, isso não resolverá o problema subjacente. As condições de reticulação e têmpera precisam ser consideradas antes de adotar um programa mais agressivo.

Por que a entrada da célula e Lise é importante?

Um excesso de células em pequena quantidade pode criar cromatina espessa e pegajosa, que se corta irregularmente. Material inicial muito baixo pode aumentar as perdas de manuseio e dificultar a avaliação da qualidade da cromatina.

O número de células entre os experimentos deve ser igualado. Amostras de tecido exigem cuidado extra, pois há alto risco de obter um lisado heterogêneo devido a material extracelular, diferenças estruturais e dissociação incompleta.

Antes da sonicação, a liberação eficaz dos núcleos e da cromatina é crucial. A lise incompleta pode resultar na presença de núcleos não quebrados ou aglomerados de células expostos à energia de forma diferente do restante da amostra.

Quão Focado Ultrassonação Ajuda a melhorar o controle?

Sonicadores de sonda são usados onde a energia é passada diretamente para a amostra. Variabilidade e potencial de contaminação podem resultar da posição da sonda, profundidade de imersão e técnica do operador.

A ultrasonicação focada é usada para direcionar energia acústica, através de um meio de acoplamento, para um recipiente de amostra fechado. Isso resulta em um ambiente de processamento mais controlado e sem contato.

O Ultrasonicador focado BoFU-100 fornece cisalhamento de DNA, RNA e cromatina controlados por temperatura. O Sistema BoFU-1600 oferece a opção de um fluxo de trabalho de laboratório multicanal ao processar múltiplas amostras.

Quais parâmetros devem ser otimizados?

Intensidade acústica, ciclo de trabalho, tempo de tratamento, número de ciclos, tempo de pausa, volume da amostra e temperatura da amostra são variáveis importantes.

Altere uma variável principal de cada vez durante a otimização inicial. Quando intensidade, duração e/ou concentração celular variam simultaneamente, pode ser difícil determinar se o resultado foi melhor ou pior devido a qualquer uma das mudanças.

Teste uma pequena matriz de condições em torno de um ponto de partida razoável e compare distribuições de fragmentos e recuperação de DNA

- NÃO o tratamento mais forte que resulta no DNA-de-menor para o mesmo!

Após a seleção de um programa, salve-o com a entrada de medição da célula, buffer, tubo e volume da amostra. Sem essas condições associadas, os parâmetros de sonicação não podem ser reproduzidos de forma confiável.

Por que isso acontece Importante que as amostras devem ser mantidas frias?

O tratamento ultrassônico é acompanhado por efeitos de aquecimento e a cromatina pode ser sensível ao calor. Danos proteicos, perda de reconhecimento de anticorpos e aumento da variabilidade podem ser fatores de calor.

O resfriamento durante toda a execução deve ser o mesmo (mesmo durante o descanso entre as execuções). A velocidade de movimento dos tubos entre um balde de gelo e o instrumento não deve afetar a temperatura da amostra.

Cisalhamento Qualidade Confere: Como?

Após o cisalhamento, retire uma alíquota representativa. Inverta as ligações cruzadas, limpe o DNA e avalie toda a distribuição do tamanho dos fragmentos com eletroforese em gel de agarose ou um analisador automatizado de fragmentos apropriado.

Não avalie cromatina reticulada não tratada como se fosse DNA purificado. O tamanho aparente pode ser enganoso devido a uma mudança na migração causada por proteínas e ligações cruzadas.

A maior parte do material deve estar dentro dos limites da faixa "aceita" do laboratório, com pouca ou nenhuma grande população de material de alto peso molecular. A quantidade de DNA recuperada também deve ser medida, pois um bom perfil não é valioso se grande parte do DNA foi perdida.

Por que existe Inconsistente Cisalhamento por cromatina?

Esses fatores se devem à fixação variável, contagens celulares imprecisas, lise incompleta, volume variável da amostra, tipos variáveis de tubos e deriva de temperatura.

Espuma ou bolhas de ar são um problema que pode afetar o acoplamento acústico. Portanto, tubos de amostra devem ser preenchidos, tampados e colocados da mesma forma. Para o desenvolvimento de métodos, tubos de tipo validado/lote validado são preferidos.

Se houver variação entre os resultados de um lote, isso pode indicar que há efeitos na posição da amostra ou que o tempo de preparação da amostra pode ter sido inconsistente. Um registro simples de execução pode ser útil para ver se há alguma variação relacionada ao biológico, procedimentos ou instrumentos.

Como um novo tipo de amostra deve ser otimizado?

Comece com uma fixação pequena e matriz acústica com material representativo de experimentos reais. Não use um espécime valioso ou não substituível para o teste inicial.

Avalie a distribuição de fragmentos, a recuperação de DNA e o desempenho em imunoprecipitação. Após o cisalhamento, a adequação da cromatina para ChIP pode ser avaliada usando um anticorpo controle positivo e loci-alvo conhecidos.

Uma vez otimizado, defina os parâmetros críticos em uma SOP. Para mais informações sobre ultrassom focado para preparação da cromatina, consulte o documento de Longlight Página de aplicação ChIP.

Conclusão

Não se trata apenas do poder ultrassônico para fazer cisalhamento confiável da cromatina. Os diversos componentes de fixação, entrada de células, lise celular, geometria da amostra e condições acústicas e de temperatura devem ser todos compatíveis.

O método ideal gera a distribuição adequada dos fragmentos e mantém o desempenho de imunoprecipitação e recuperação do material. Cada laboratório é bem-vindo para entrar em contato com a Longlight através da página de contato para fornecer informações sobre o tipo e lote de sua amostra e o fluxo de trabalho ChIP que desejam usar, para suporte a equipamentos e aplicações.

FAQ

Q1. Por que há necessidade de cisalhamento da cromatina?

Ele quebra a cromatina reticulada em pedaços menores para IP. O uso de fragmentos de tamanho controlado aumentará a resolução do ChIP-qPCR e do ChIP-seq.

Q2. O que aconteceria se a cromatina fosse cortada por baixo da apara?

Peças muito grandes podem causar perda de resolução e aumento do fundo inespecífico. Considere reavaliar a fixação, lise e condições acústicas antes de prolongar automaticamente o tratamento.

Q3. É possível fazer uma sobre-cisalhamento da cromatina?

Sim. Se for usado tratamento excessivo, a recuperação será prejudicada ou epítopos proteicos e complexos DNA–proteína serão danificados. Nem sempre é uma boa ideia usar fragmentos mais curtos.

Q4. A cromatina precisa ser mantida no gelo durante a sonicação?

Sim. O processamento em baixa temperatura é estável, o que ajuda a reduzir os danos causados pelo calor às amostras e proteínas. A temperatura deve ser constante entre amostras e lotes.

Q5. Existe uma única cromatina-elaaPrograma em anel que seja aplicável a todos os tipos de células?

Geralmente não. A diferença entre estrutura celular, densidade de cromatina, resposta de fixação e concentração da amostra existe, e novos tipos de amostra devem ser submetidos a otimização limitada.