Separações de Grande Volume que Preservam Biomoléculas Sensíveis

Separações de Grande Volume são essenciais para a produção de vacinas, terapias gênicas e proteínas recombinantes. No entanto, as condições que permitem a escala — altas taxas de fluxo, forças de cisalhamento e pressão — frequentemente degradam biomoléculas sensíveis. Proteínas desnaturam. Fragmentos de DNA. Vetores virais perdem potência.

Intensificação do processamento a jusante com separação magnética

Técnicas tradicionais de separação foram criadas para moléculas pequenas. Os biológicos são maiores e muito mais sensíveis do que moléculas pequenas. Os biológicos exigem técnicas de separação para preservar a integridade e a sensibilidade da biomolécula para que o produto seja útil. Este artigo mostra uma das muitas vantagens do uso de um processo de separação magnética, para a biomolécula, ao mostrar a sensibilidade da separação magnética durante a Separação de Grande Volume.

Métodos Tradicionais de Separação

Quando a maioria dos engenheiros considera o valor das biomoléculas perdidas após o processo de separação, eles falam sobre a eficiência do fator de ligação à biomolécula e a recuperação da elução. No entanto, a maior parte da degradação do produto ocorre antes do cálculo dos rendimentos e durante a fase de separação.

Métodos tradicionais de separação expõem moléculas a diversas formas físicas e químicas nocivas durante a fase de separação.

• Separação de membranas e colunas: Os fluxos que separam as biomoléculas causam dobramento, rotação e rearranjo das moléculas estruturais e poliméricas flexíveis, causando degradação substancial e, às vezes, irreversível.

• Separação por aquecimento ou resfriamento: A maioria dos métodos tradicionais de separação requer ciclos de aquecimento e resfriamento das biomoléculas. Isso leva à destruição das biomoléculas e à formação de agregados.

• Separação, ou seja, impulsionada por pressão: O fluxo mecânico e tangencial de biomoléculas ligadas à superfície do filtro pode causar uma fratura que é de cisalhamento ou irreversível quando a biomolécula é perdida.

• Separação por meio do uso de tampões de elução: A mudança no ambiente químico e nos tampões de elução com pH mais baixo (ou às vezes mais alto) pode alterar a conformação da biomolécula.

A Dra. Lydia Kisley e sua equipe da Case Western Reserve University mostraram que alguns materiais comerciais de separação rotulados como "totalmente porosos" possuem seções centrais que são em sua maioria inativas. Isso significa que os fabricantes estão pagando por toda a capacidade, mas recebem apenas uma pequena parte do desempenho potencial. Isso, combinado com tempos de processamento prolongados, pode levar à degradação das biomoléculas.

Intensificação do processamento a jusante com separação magnética

Quando tomadas de forma cumulativa, a diminuição da atividade específica, o aumento da agregação de biomoléculas e a redução dos rendimentos finais resultam em reprocessamento caro.

Por que os métodos convencionais de processamento Cum't Desenvolvimento Adicional

Métodos laboratoriais possuem muitos métodos de separação que podem ser usados, muitos que podem se tornar impraticáveis em escala industrial.

Um exemplo de método com problemas de escala é o uso de colunas de cromatografia.

• Transporte estreitado do alvo: Na cromatografia de leito compactado, a ligação ocorre por meio da difusão de um analito. Para biomoléculas de tamanho superior a 100 Da, o tempo de difusão é próximo à superfície de ligação e a área substancial é excluída.

• Obstrução: Para evitar obstruções em colunas em escala industrial, o fluxo de alimentação é prevenido e é pré-esclarecido.

• Aumento do consumo de buffers: Colunas em escala industrial criam uma grande quantidade de buffer usado, o que aumenta o custo para a operação.

• Sensibilidade ao cisalhamento durante o empacotamento e operação: As forças mecânicas necessárias para manter um enchimento uniforme em escala podem danificar as próprias biomoléculas que a coluna foi projetada para purificar.

Os pesquisadores Julian Galbusera, Ines Zimmermann e Paula Fraga-García, da Universidade Técnica de Munique, documentaram como a tecnologia de separação magnética resolve esses gargalos. Em contraste com a cromatografia padrão, em que a fase estacionária é uma matriz de esferas compactadas permeadas por um fluido móvel, a separação magnética processa o fluxo de alimentação diretamente suspendendo as partículas magnéticas funcionalizadas. Isso permite que as barreiras de difusão que geralmente afligem a cromatografia sejam completamente contornadas, tudo isso enquanto operam em grande escala e processam lisados não esclarecidos.

A Alternativa Magnética: Suave, Rápida e Escalável

Os princípios da separação magnética são fundamentalmente diferentes. Partículas magnéticas funcionalizadas têm como alvo espécies moleculares específicas em suspensão. A aplicação de um campo magnético externo captura os complexos partícula-alvo e permite a limpeza rotineira de espécies indesejadas. O complexo de espécies partícula-alvo é protegido contra tensões de cisalhamento e térmicas durante o processamento.

Para processos de separação em grande volume, as vantagens dessa técnica do ponto de vista da separação de biomoléculas sensíveis são várias:

• Não é necessária difusão através dos poros: Partículas magnéticas são tipicamente não porosas. Assim, a etapa lenta de difusão, que é uma etapa que limita a cinética de ligação de todos os métodos cromatográficos, é contornada. Vale mencionar que grandes biomoléculas se ligam diretamente às superfícies das partículas.

• Captura e liberação suaves: O campo magnético aplica uma força volumétrica suave em contraste com a pressão muito alta e a densidade de empacotamento muito altas que são características das colunas de leito compactado. As células permanecem intactas. Vetores virais mantêm a infectividade. As estruturas proteicas permanecem dobradas.

• Processamento direto de cargas brutas: A separação magnética pode lidar com fluxos de alimentação turvos e carregados de partículas sem pré-filtração. Isso elimina uma ou mais operações unitárias do trem a jusante.

• Consumo mínimo de buffer: Como as partículas magnéticas são suspensas e recuperadas em vez de fixas em uma coluna, os volumes de buffer podem ser drasticamente reduzidos, diminuindo tanto o custo quanto o impacto ambiental.

Um estudo de 2023 publicado na revista Molecular Therapy—Methods & Clinical Development demonstrou a aplicação prática desse princípio. Pesquisadores desenvolveram um método de captura magnética sem filtro para purificar o vírus adeno-associado recombinante (rAAV5) diretamente do lisado celular. Em menos de duas horas, alcançaram um rendimento de recuperação de 63% a partir de aproximadamente 5 litros de lisato, com uma redução de três logaritarinos no DNA da célula hospedeira e nas proteínas da célula hospedeira, eliminando completamente as etapas de filtragem em profundidade e cromatografia em coluna.

Desempenho no Mundo Real aEscala de Produção t

A questão para os fabricantes industriais não é se a separação magnética funciona em laboratório — mas sim se ela funciona de forma confiável em volumes de produção. As evidências continuam a se acumular em afirmação.

• Purificação de proteínas em escala de litro: Pesquisas publicadas no ACS Omega demonstraram que um processo de pesca magnética em uma única etapa poderia alcançar 91% de pureza da proteína fluorescente verde (GFP) diretamente a partir do lisado de células brutas de Escherichia coli em volumes em escala de litro, usando nanopartículas de óxido de ferro nu produzidas por síntese simples por coprecipitação.

• Separação magnética de alto gradiente em escala maior: Muitos dos mesmos princípios de separação magnética de alto gradiente (HGMS) que permitem a purificação em laboratório são usados na produção de vacinas industriais de mRNA. Um grupo criou uma câmara de separação descartável de HGMS impressa em 3D a partir de um material compatível com a USP Classe VI. Nesse caso, a câmara operava com vazão de 150 mL por minuto, com retenção superior a 99,39%. Isso significa que os métodos de separação magnética mantêm a eficiência de captura em taxas de fluxo usadas em Separações de Grande Volume.

• Aplicações em terapia celular: Sistemas de separação magnética usados para automatizar o isolamento de células T atingem mais de 85% de eficiência e mais de 96% de pureza, em escala pronta para cGMP para pesquisa e fabricação, em 70 a 100 minutos.

Tecnologia Longlight: Engenharia fou tele Long Run

Tecnologia de separação que oferece serviço contínuo de alto volume faz da Longlight Technology o foco em engenharia.

No campo da separação magnética, os sistemas da Longlight são projetados para manter consistentemente uma intensidade uniforme do campo magnético em grandes volumes de captura – um dos requisitos mais críticos para fornecer resultados reprodutíveis lote após lote. A reprodutibilidade de lote a lote em separações de grande volume é o que ambientes regulados para manufatura simplesmente não conseguem tolerar.

A coleção de sistemas oferece respostas para os desafios específicos que o processamento em grande volume implica:

• Captura de forças magnéticas altamente concentradas em toda a zona de captura: Isso se refere ao problema da distribuição desigual de um gradiente decrescente de campo magnético, pelo qual algumas partículas são capturadas com alta eficiência e outras permanecem. Eles são capturados e depois escapam, diminuindo o rendimento e proporcionando variabilidade.

• Câmaras de separação (vasos) capazes de captura eficiente à medida que o volume da câmara aumenta de um pouco acima da escala de bancada para o lote em escala de produção.

• Flexibilidade do processo: O sistema não precisa realizar modificações significativas para acomodar diferentes tipos de partículas magnéticas, ligantes e procedimentos operacionais.

Além do Compromisso

O equilíbrio entre os biomakers na escolha entre eficiência na separação ou preservação da biomolécula está chegando ao fim. Tecnologia que utiliza ímãs nas operações não é algo que a indústria ainda esteja testando. É uma prática industrial estabelecida e é comprovada em diversos artigos revisados por pares. Esses produtos podem ser encontrados nos estoques de diversos produtores e fornecedores indiscutíveis do setor.

Em aplicações onde o valor da partícula final (fechamento do gene, fechamento do m RNA, fechamento de anticorpos monoclonais, células e produtos celulares, etc.) é a característica distintiva, separação magnética:

1. Mantém a atividade biológica perdida na separação convencional;

2. Elimina várias operações de separação ao clarificar a alimentação inicial.

3. Requer menos tampão e menos contato com os produtos químicos.

A 4.II é facilmente modificada de P&D para a linha de produção completa.

A base científica é bem estabelecida. A engenharia é madura. A questão agora não é se a separação magnética pertence ao bioprocessamento em grandes volumes, mas quão rápido os fabricantes a adotarão para proteger o que mais importa — as moléculas que entregam valor terapêutico.

Para explorar como sistemas de separação magnética podem lidar com separações de grande volume no seu processo específico, visite www.longlight.com para especificações técnicas e suporte à aplicação.

Perguntas Freqüentes

P: Um grande volume de lisados celulares não clarificados pode ser processado por separação magnética?

R: Sim. A separação magnética pode ser realizada em fluxos de alimentação com alta turbidez e não requer pré-filtração do fluxo de alimentação, reduzindo assim o número de operações unitárias.

P: É verdade que a atividade proteica sofre menos degradação na separação biomagnética?

R: Sim. Os métodos de separação biomagnética não estão sujeitos a alta pressão/velocidade nem ao uso de sistemas tampão severos para separar e recuperar biomoléculas.

P: A separação magnética pode ser ampliada de laboratório para uso comercial/industrial?

R: Sim. A física da captura magnética opera da mesma forma em sistemas de mililitros e cem litros de qualquer volume.

P: Quais biomoléculas podem ser processadas facilmente com separação magnética em grandes volumes?

R: Vetores virais, mRNA, rProteínas, exossomos e células, etc. Esses materiais são suscetíveis a tensões mecânicas ou térmicas.