Focused Acoustic Shearing: The Acoustic Path Matters More Than the Power Number

Um protocolo focado de cisalhamento acústico é uma ideia simples em princípio.

Coloque a amostra em um tubo. Selecione o método. Aplique energia acústica. Observe a distribuição dos fragmentos.

No entanto, muita coisa já aconteceu entre o transdutor e os fragmentos finais de DNA ou cromatina. A energia acústica foi transmitida através de um meio de acoplamento, para dentro do recipiente da amostra, interagiu com o líquido e resultou em um ponto final de fragmentação.

O caminho é importante.

Assim, laboratórios que testam o cisalhamento acústico focado devem considerar mais do que apenas uma configuração de potência. O fluxo de trabalho do Longlight descreve a fragmentação mecânica controlada como uma das etapas essenciais da preparação de amostras de NGS, nas quais fragmentos de ácido nucleico são processados por ultrasonicação focada para obter fragmentos de ácido nucleico mais uniformes para processos de fluxo de trabalho posteriores.

O tossamento começa antes que o som alcance o DNA:

Não há um "número de potência" para a amostra.

É um sistema físico que recebe energia acústica após sua passagem pelo sistema.

Com ultrasonicação focada, a amostra fica contida em um recipiente fechado e a energia acústica é direcionada através de um meio controlado e focada em direção à região da amostra. Longlight afirma que seus sistemas BoFU são diferentes dos tradicionais sonicadores de banho e sonda porque a energia acústica é direcionada para o recipiente da amostra em vez da sonda.

Isso eleva o significado de um protocolo como um todo a um novo patamar.

Transdutor, meio acústico, geometria do vaso, posição da amostra e volume de líquido não são acessórios independentes em torno do experimento. Esses conjuntos são combinados e formam o caminho acústico.

Nesse caso, o tubo de amostra é um componente do sistema acústico

Tubos de amostra podem ser facilmente tratados como consumíveis genéricos.

No caso do cisalhamento acústico focado, essa suposição vale a pena ser reavaliada.

A geometria desempenha um papel na introdução da energia acústica no recipiente. A transmissão e a transferência de calor são influenciadas pelo material. A zona focal acústica e o tubo também podem impactar a uniformidade da exposição da amostra às condições desejadas.

O BoFU-UniTube da Longlight foi desenvolvido especificamente para sistemas de ultrasonicação focada BoFU e não como um tubo genérico de ensaio. O acoplamento acústico, a transmissão controlada de energia e o gerenciamento térmico são destacados em sua descrição do produto como parte do projeto do tubo.

Isso resulta em uma diretriz simples de desenvolvimento de métodos:

Quando um protocolo de fragmentação foi validado, nunca se considere certo que o protocolo acústico não mudou.

A cavitação não deveria ser responsabilidade do operador

A sonicação por sonda permite a inserção física do sonicador na amostra.

Existe outra forma de processamento acústico focado. A amostra permanece firmemente fechada durante a transmissão do ultrassom no meio acústico.

Isso tem implicações por dois motivos.

Primeiramente, elimina a profundidade da sonda e o contato direto da sonda no procedimento rotineiro de manuseio da amostra. Em segundo lugar, reduz a dependência da geometria da entrega do posicionamento manual de uma sonda de uma execução para outra por um operador.

A tecnologia de processamento sem contato na Longlight Ultrassônico Focalizado BoFU-100 funciona transmitindo energia acústica focada através de um meio acústico, mas a amostra biológica é mantida afastada da sonda.

Isso não significa que a otimização de protocolos desaparece.

Isso significa que as variáveis são deslocadas da posição da mão para qualquer sistema acústico mais bem definido.

Um Ponto Final de Fragmento é preferível a um Ponto Final de Energia

Um erro típico no desenvolvimento do método é o seguinte pensamento:

As mesmas configurações acústicas foram usadas, portanto o experimento foi o mesmo", dizem eles.

Esse pode não ser o destino mais produtivo.

O foco do pesquisador geralmente está no resultado do cisalhamento, por exemplo: distribuição do tamanho dos fragmentos, recuperação da amostra, compatibilidade com a preparação da biblioteca, adequação da cromatina ou outro critério posterior.

Portanto, a otimização de protocolos deve ser feita no sentido inverso.

Decida primeiro o produto final desejado da biologia ou da análise. Depois, determine as condições acústicas que a produzem repetidamente.

No caso do DNA genômico, pode ser uma distribuição fragmentada adequada para um processo específico de preparação de biblioteca NGS. O desfecho aceitável para a cromatina pode ser diferente, já que o experimento posterior pode estar fazendo uma questão biológica diferente.

Ambos podem ser alimentados pelo mesmo instrumento, para energia acústica. Isso não significa que sejam o mesmo método de tosquia, no entanto.

O experimento acústico pode ser facilmente modificado mudando a temperatura, o que pode produzir mudanças silenciosas.

Energia mecânica não pode ser colocada em uma amostra sem consequências.

Um deles é o calor.

Um protocolo que aumenta a temperatura da amostra durante o protocolo não pode ser executado exatamente no mesmo ambiente durante todo o protocolo. Isso é ainda mais importante no caso de materiais biológicos sensíveis à temperatura, como ácidos nucleicos e cromatina.

O Ultrasonicador Focado BoFU-800 segundo Longlight, é um ambiente de processamento isotérmico sem contato com controle de temperatura, projetado para minimizar os efeitos do calor gerado durante o processo de ultrassonação. O sistema também pode acomodar de 1 a 8 amostras e possui condições personalizadas ou em lote individualmente.

Assim, a temperatura deve ser registrada no registro do método junto com as condições acústicas e as informações da amostra.

Não é apenas uma funcionalidade de conforto do instrumento.

Tanto o Cisalhamento de DNA quanto o Cisalhamento de Cromatina não devem fazer suposições!

Existem vários trabalhos biológicos para o "cisalhamento acústico".

A fragmentação do DNA genômico pode ser otimizada para alcançar uma distribuição desejada de fragmentos de ácido nucleico a serem sequenciados. O material biológico que envolve o DNA, bem como as necessidades de fluxo de trabalho de cromatina a jusante, também devem ser considerados ao cisalhar a cromatina.

Da mesma forma, o processamento de FFPE, a ruptura de tecidos e a lise celular criam estruturas de amostra totalmente diferentes.

Essa é uma das razões pelas quais uma plataforma acústica ampla pode ser benéfica, mas também é uma razão pela qual os laboratórios não devem trabalhar em direção a um único protocolo universal de sonicação.

O Ultrasonicador Focado BoFU-1600 da Longlight inclui diversas aplicações, incluindo fragmentação do genoma, preparação genômica/proteômica, ruptura celular e tecidular, e processamento FFPE. Também pode processar amostras usando condições individuais ou parâmetros comuns de lote, pois possui um design de 16 posições.

A tecnologia acústica pode ser compartilhada com várias aplicações.

As configurações acústicas não deveriam ser as mesmas por padrão.

Em uma transferência de método, mais de três números devem estar envolvidos

Em muitos casos, quando um método de cisalhamento acústico focado é transferido entre laboratórios, são os ajustes óbvios que são utilizados.

Isso é apenas uma parte do protocolo.

Tipo de amostra, quantidade ou concentração da entrada da amostra, volume de trabalho, vaso de amostra, condições acústicas, temperaturas, modo de processamento e método de controle de qualidade são registros de transferência mais úteis.

Isso é particularmente crítico quando operadores ou laboratórios trocam de método.

Um método que não pode ser usado sem que os desenvolvedores do instrumento apoiem o instrumento não é um método muito portátil.

A verificação de cisalhamento é realizada no final da acústica focada

Siga o caminho energético completo antes de validar um protocolo de cisalhamento acústico.

Os recipientes corretos estão sendo utilizados? O posicionamento e o acoplamento da amostra são consistentes? As condições de entrada são especificadas? A temperatura é controlada? Os critérios de recompensa/penalidade são baseados no ponto final do fragmento ou apenas na configuração do instrumento?

A abordagem mais eficaz para o cisalhamento acústico focado é considerar a energia acústica como um elemento em um sistema controlado de processamento de amostras.

Não é apenas uma questão de quanta energia o instrumento produz.

É a consistência com que a quantidade apropriada dessa energia chega à amostra apropriada sob as condições apropriadas.

FAQ

P1. O que é a cisalhamento acústico focado?

Cisalhamento Acústico Focado é um método de cisalhamento mecanico de material biológico, por exemplo, DNA, cromatina, utilizando energia ultrassônica concentrada. Sistemas focalizados podem ser usados para fornecer energia acústica em um recipiente de amostra selado sem a necessidade de uma sonda tocar na amostra.

P2. Existe necessidade de cisalhamento acústico focado para NGS?

Sim. Uma das aplicações listadas pela Longlight para seus sistemas de ultrassonização focalizados e seu fluxo de trabalho de cisalhamento de DNA/RNA é a fragmentação controlada do DNA.

P3. O cisalhamento acústico focado é o mesmo que a sonda sonorizada?

Existem dois tipos de sonação com sonda: Não. Sonda Sonicação: uma sonda de sonicação é colocada dentro da amostra; Sistemas Acústicos Focados: eles podem sonicar um vaso de amostras fechado através de um meio acústico.

P4. Existem efeitos do cisalhamento acústico nos tubos de amostra?

Pode. Para um sistema acústico focado, a geometria do vaso, o acoplamento acústico e o comportamento térmico fazem parte do caminho de transferência de energia e, portanto, válvulas acústicas projetadas especificamente podem ser usadas.

P5. É possível usar o mesmo sistema acústico focado para DNA e cromatina?

Embora uma plataforma de ultrasonicação focada possa ser usada para ambas as aplicações, é importante não assumir que os mesmos protocolos funcionarão para ambas. A otimização do método deve ser baseada no ponto final e na estrutura da amostra.