Como um ultrasonicador de cisalhamento de DNA entrega fragmentos prontos para NGS em minutos

Um Ultrasonicador de Cisalhamento de DNA confiável é a base para a preparação consistente de bibliotecas de sequenciamento de próxima geração (NGS); A qualidade da fragmentação determina diretamente a uniformidade da cobertura, a precisão das chamadas variantes e a complexidade da biblioteca, moldando cada análise a jusante. À medida que as plataformas de sequenciamento avançam e o rendimento da amostra aumenta, os laboratórios precisam de instrumentos que mantenham a integridade da amostra enquanto produzem distribuições reprodutíveis do tamanho dos fragmentos.

Otimização das técnicas de fragmentação do DNA para

Maximizar a uniformidade da cobertura de genes clinicamente relevantes usando sequenciamento do genoma completo

Atuadores Ultranonicos Focados (FUA) utilizam o Ultrasonicador Focado BoFU-800 da Longlight Technology para atender às necessidades dos laboratórios. Pela primeira vez, laboratórios podem ter fragmentos de DNA prontos para NGS em questão de minutos.

A Importância da NGS e o Valor do Cisalhamento Eficiente do DNA

Ao contrário do que se pensa, a fragmentação do DNA não é o primeiro passo em um processo de processamento. A qualidade dos dados produzidos é resultado direto dos fragmentos de tamanho produzidos. Alcançar uma cobertura suficiente das variantes de baixa frequência deve ser em torno de uma distribuição de Poisson. A fragmentação do DNA deve ser suficientemente compacta para contribuir para uma biblioteca de maior densidade, e variantes distribuídas por Poisson não devem ser confundidas com variações do número de cópias que surgem de pontos de quebra de cobertura baixos.

Embora o custo inicial da fragmentação enzimática seja significativamente menor, o viés de sequência é mais comum. Esses vieses tendem a produzir mais variância nos dados coletados. Numerosos estudos realizados pela Discovery Life Sciences demonstram que um tamanho mais consistente para fragmentos foi obtido com métodos de cisalhamento de fragmentação de DNA a partir de amostras de FFPE de baixa entrada. Para fluxos de trabalho em ambientes laboratoriais com volume de amostras muito baixo ou onde a preservação da amostra é uma preocupação, essa previsibilidade da fragmentação mecânica é uma vantagem distinta.

Um Ultrasonicador Focado em Cisalhamento de DNA vs. Sonicadores Tradicionais

Um Ultrasonicador de Cisalhamento de DNA Focado utiliza ultrassom focado de alta frequência na amostra. Em contraste com isso, sonadores convencionais do tipo sonda e banho-maria usam energia dispersa e precisam de contato direto com amostras.

Um exemplo desse sistema inclui o BoFU-800 e seu uso da tecnologia de ultrassom confocal, levando ao seguinte.

1. Fragmentação controlada e repetível: a incidência de pico e largura de pulso pode ser ajustada ao DNA a ser fragmentado, por exemplo, na faixa de 300 a 600 bp para Sequenciamento Completo do Genoma (WGS), ou de 250 a 350 bp para Sequenciamento Completo do Exoma (WES).

2. Processamento de amostras sem contato: as amostras não precisam ser retiradas de tubos pré-selados de alta qualidade, com fechamentos herméticos e herméticos mantidos para garantir que a amostra ou qualquer material nuclear valioso contendo não seja danificado.

3. Operação verdadeira em baixas temperaturas: o sistema de condensação é de alta qualidade, levando a um balanço isotérmico in situ sem a cadeia de eventos de reações endotérmicas ou esclarecimento causado pela alta temperatura na amostra sujeita ao explosão extremamente alto de energia.

Quando a potência de pico de incidência é calibrada adequadamente, fragmentos de tamanho tão pequeno quanto 120-150 bp podem ser alcançados de forma reprodutível entre múltiplas amostras. O BoFU-800 pode processar de 1 a 8 amostras simultaneamente, com configurações de condição independentes por poço ou modo lote para uniformidade em um clique — dando flexibilidade aos laboratórios sem sacrificar a consistência.

Da Amostra ao Sequenciamento-Biblioteca Pronta em Minutos

Eficiência de tempo é fundamental em um ambiente de laboratório movimentado. Um Ultrasonicador de Cisalhamento de DNA de última geração pode melhorar significativamente a eficiência do fluxo de trabalho:

• Redução do tempo de uso prático: O BoFU-800 vem com um sistema operacional integrado, o que significa que um computador externo não é mais necessário e a saturação de bancada é reduzida.

• Flexibilidade no processamento em tempo real: O modo livre permite o tratamento individual de cada amostra, enquanto o modo de processamento em lote aplica os mesmos parâmetros para um lote inteiro para um processamento eficiente em tempo.

• Prontidão para análise rápida de fragmentos: Os tamanhos estreitos e consistentes dos fragmentos produzidos pela ultrasonicação focada eliminam a necessidade de uma etapa demorada de preparação da biblioteca.

Em ambientes com processamento clínico de amostras e tempos de resposta medidos em dias, não semanas, tudo isso equivale a resultados laboratoriais mais rápidos. O dispositivo conta com drenagem automatizada com remoção de resíduos em um clique, sensor de nível de água embutido com sistema de alerta antecipado e um ciclo operacional eficiente em tempo, reduzindo o tempo de inatividade dos lotes e aumentando o tempo contínuo de operação até o tamanho das subunidades.

Compatibilidade com Difícil e Baixo-Amostras de entrada

Um verdadeiro Ultrasonicador de Cisalhamento de DNA aproveita recursos únicos de processamento de amostras quando o processamento é difícil. Tecidos FFPE, biópsias líquidas e amostras clínicas degradadas, entre outras, apresentam o processamento de amostras mais difícil e desafiador disponível para um laboratório moderno. Métodos tradicionais de extração e cisalhamento de amostras não são racionalmente transportáveis nem adotáveis diante da extrema variabilidade e dos desafios de processamento de amostras, levando a tamanhos de fragmentos ruins e impraticáveis, ou à falha de toda a preparação da biblioteca.

A ultrasonicação focada ajuda a aliviar essas preocupações. Quando combinada com protocolos de extração, a extração aprimorada acústicamente gera métricas de melhor qualidade a partir de amostras arquivadas de FFPE em comparação com métodos convencionais baseados em colunas. O BoFU-800 estende a funcionalidade até a etapa de cisalhamento:

• Baixa compatibilidade de entrada: O sistema efetivamente corta DNA para aplicações de pequeno volume, alcançando alta capacidade de recuperação.

• Desparafinização de tecido FFPE e extração de DNA: O mesmo princípio focado do ultrassom auxilia no fluxo de trabalho a partir de blocos de tecido tumoral e amostras líquidas de biópsia.

• Cisalhamento da cromatina para ChIP-seq: Além do cisalhamento do DNA, o dispositivo pode ser utilizado para imunoprecipitação de cromatina, fornecendo funcionalidade para a pesquisa em epigenética do laboratório.

• A capacidade do sistema de cortar paredes celulares resistentes e preservar analitos a jusante aumenta a eficiência dos pesquisadores que utilizam fungos filamentosos ou MALDI-TOF MS para identificação de Mycobacterium.

Como se consegue uma preparação bem-sucedida de bibliotecas para amostras de baixa qualidade e baixa entrada?

A tecnologia de preparação de bibliotecas de uma única linha aumenta significativamente a taxa de sucesso!

O conjunto de funcionalidades de processamento em lote e resultados reprodutíveis do BoFU-800 oferece soluções flexíveis para a preparação automatizada de bibliotecas como componente essencial do sequenciamento previsível de ponta a ponta.

Instrumentos de leitura longa precisam de fragmentos de 10 kbp ou mais sem viés. Pesquisas exploraram o uso de esferas para alcançar um cisalhamento de 10-20 kbp para sequenciamento de molécula única. O BoFU-800 é otimizado para cisalhamento na faixa de 150-600 bp, mas acústica focada também oferece potencial para cisalhamento mecânico escalar com sequenciamento.

Um Ultrasonicador de Cisalhamento de DNA que abrange amplas gamas de cisalhamento oferece ao laboratório a flexibilidade para atender a aplicações diversificadas.

Construindo um Fluxo de Trabalho Consistente de NGS

Na genômica, a melhor moeda que se pode ter é a reprodutibilidade. Infelizmente, todo método de preparação de biblioteca expõe os laboratórios a uma certa variabilidade técnica. O objetivo de toda empresa de tecnologia é projetar seus dispositivos para reduzir a variabilidade ao mínimo necessário. Um Ultrasonicador de Cisalhamento de DNA calibrado de fábrica (com construção correta) beneficia você por:

1. Uso confiável do instrumento: Como todos entregam a mesma quantidade de energia por poço de amostra, todos os seguros do Ultrasonicator são calibrações de fábrica únicas.

2. Histórico de processamento de amostras: O Ultrasonicador documenta os parâmetros e condições de processamento, e dá ao operador a capacidade de acessar total transparência experimental dos dados e prontidão para auditoria.

3. Minimização da variabilidade do operador: Devido ao processamento em lote e ao risco de variabilidade do operador é eliminado.

Esses recursos não são meramente melhorias de conveniência; Eles são pré-requisitos para a transição de pesquisas em escala de descoberta para aplicações diagnósticas reguladas, onde a consistência entre lotes e operadores é obrigatória.

Conclusão

A genômica moderna exige maior rendimento, menor entrada e controle de qualidade mais rigoroso. Um Ultrasonicador de Cisalhamento de DNA como o BoFU-800 entrega fragmentos prontos para NGS em minutos por meio de energia acústica focada, processamento sem contato e controle de temperatura real em um design compacto e amigável para lotes. Ao permitir fragmentação consistente entre 1 e 8 amostras e apoiar aplicações desde extração com FFPE até cisalhamento de cromatina, o BoFU-800 ajuda os laboratórios a alcançar a reprodutibilidade e eficiência que resultados confiáveis de NGS exigem — menos resolução de problemas, mais descobertas.

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Perguntas frequentes

P: O BoFU-800 pode cortar DNA rapidamente para NGS?

R: A velocidade das fragmentações depende da amostra. A maioria das amostras fragmenta para a faixa alvo entre 150-600bp em apenas alguns minutos.

P: As amostras podem ser danificadas devido ao aquecimento ao usar a ultrasonicação focada?

R: O BoFU-800 tenta controlar a temperatura para que seja isotérmica. Assim, as amostras não são danificadas devido ao aquecimento.

P: Posso processar amostras com condições variadas em uma única execução?

R: Sim. O modo livre permite definir os parâmetros para todos os 8 poços de forma independente, enquanto o modo lote define os mesmos parâmetros para todos os poços.

P: O BoFU-800 pode ser usado com amostras de baixa entrada ou amostras FFPE? R: Sim. A acústica focada é capaz de usar até 1 ng de DNA. O uso de tubo fechado também é útil para a preservação das amostras extraídas com FFPE.

P: Preciso ter meu próprio computador para operar o dispositivo?

R: Não. O BoFU-800 tem um sistema operacional embutido, então você não precisa de um computador extra. Assim, ocupando menos espaço na bancada para a configuração.